更新時間：2019-02-11, 來源：國家實驗動物專家委員會簡報 2019年第7期2227
編者：1988年《實驗動物管理條例》發(fā)布實施，在實驗動物工作規(guī)范化、法制化管理，保障實驗動物和動物實驗的質(zhì)量，推動我國科技發(fā)展和民生保障等方面發(fā)揮了重要作用。特別是在實驗動物資源標準化、新品種/品系開發(fā)和動物模型創(chuàng)制方面，取得了令人矚目的成果。
資源增量是實驗動物科技發(fā)展的核心任務(wù)，是實驗動物對生命科學(xué)研究提供支撐和服務(wù)的基礎(chǔ)和保障。自上世紀80年代以來，我國老一輩實驗動物科學(xué)家苦心孤詣，在實驗動物資源研發(fā)工作中取得的多項開創(chuàng)新成果。在“十三五”國家重點研發(fā)計劃課題（2017YFD0501606）和中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項項目課題的支持下，以景志忠教授為首的研究團隊在實驗用合作小型豬培育與抗病免疫分子遺傳特性研究與應(yīng)用方面開展的深入研究。
為此，借“科技資訊”之窗，介紹該項目所取得的成果。
實驗用合作小型豬培育與抗病免疫分子遺傳特性研究應(yīng)用現(xiàn)狀
景志忠 陳國華 賈懷杰 房永祥 何小兵
中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室
合作豬，又稱蕨麻豬（因采食蕨麻而得名），也稱藏豬或山豬，是甘肅、青海、四川、云南、西藏等藏族地區(qū)飼養(yǎng)的一種小型原始地方豬品種。合作豬主要分布在甘肅省西南部、青藏高原的東部邊緣，中心產(chǎn)區(qū)在甘南藏族自治州的合作市以及周邊的夏河、碌曲、卓尼等縣，因而1984年被定名為合作豬[1]。
一、合作豬的基本特性與利用優(yōu)勢
（一）品種形成環(huán)境與特點
由于長期生存在惡劣高寒氣侯(海拔3000 m左右，最低氣溫-28℃,最高氣溫27.7℃，年平均溫度 1-7 ℃，溫差較大)和低劣的飼養(yǎng)條件下(終年以放牧為主，采食蕨麻等牧草的根、莖、籽及農(nóng)作物的秸稈等), 具有許多適應(yīng)高原環(huán)境的特點,即具有良好利用野生植物的能力，體質(zhì)結(jié)實、四肢健壯、性野、行動敏捷、鬃長和絨毛密生等特點。其次，由于地處偏僻山村，交通不便,長期自繁自養(yǎng)封閉繁殖，未受外來血緣的影響, 形成了一個遺傳相對穩(wěn)定、均一的原始地方豬種。其三，合作豬體型小、生長緩慢,在畜牧業(yè)生產(chǎn)中使用價值不大。據(jù)不完全統(tǒng)計，甘南州“合作豬”的數(shù)量僅有6萬多頭 ，而且大部分地區(qū)的合作豬已被雜交，豬種血緣混亂，致使這一珍貴種質(zhì)資源瀕臨滅絕，亟待保護[2,3,4]。近年來，隨著合作豬生物學(xué)價值和食用價值被重新認識，合作豬優(yōu)秀的抗逆性和肉質(zhì)特征以及適于實驗動物化培育的優(yōu)勢，成為未來發(fā)展的趨勢。
（二）品種基本特征
合作豬體型較小，性情野，行為機靈活潑[2,3,4]。合作豬毛色純黑的少，一般四肢、腹部、背部等部位為白色，被毛粗密而長，冬生棕色絨毛，鬃長且堅韌。初生仔豬背部毛色帶有棕黃色或褐色縱行條紋（松鼠背色），隨日齡增長而逐漸消失。合作豬頭窄長，呈錐形，嘴長而尖，犬齒發(fā)達，耳小向上直立，額無明顯皺紋，頸和體軀較短，胸較狹窄，背腰平直或微弓，后軀較前軀略高，臀窄而傾斜，四肢長短適中，健壯，跟系短而有力，蹄小堅實；乳頭 4-6 對，排列整齊。成年公豬體重約33.31kg，母豬約34.84 kg。母豬 4-5月齡開始配種，產(chǎn)仔數(shù)較少（平均3.6頭），繁殖率較低。合作豬日增重較低，約210.01 g/d，料肉比偏高達3.51。
（三）實驗動物化前景
合作豬體型小，易于進行微生物控制, 可培育成國際上最小的實驗用小型豬。合作豬品種純，遺傳穩(wěn)定。由于合作豬分布在偏僻的高原地帶, 很少受外來血緣的影響, 同時在畜牧業(yè)生產(chǎn)中, 因其體型小、繁殖性能較低, 一般未能進行雜交改良用于畜牧業(yè)生產(chǎn), 保存了原始的均一的矮小基因庫，且其遺傳背景比較清楚。合作豬適應(yīng)能力強,可望培育出國內(nèi)外獨特的高原型小型豬新品系。目前培育成功的貴州小型豬、版納小型豬、巴馬小型豬和五指山小型豬，其均來源于生長在海拔較低, 溫度、濕度較高的地區(qū)，而合作豬則生長在截然不同的自然環(huán)境，這是長期自然選擇的結(jié)果，其適應(yīng)性強可能有其必然性。然而，合作豬繁殖性能低，野性大，毛色雜，不利于實驗動物化培育。
合作豬體型小、品種純、適應(yīng)能力強，若能將其進行實驗動物化和小型化定向培育,使之保持體型小、抗病性強，而同時具有其它品種的優(yōu)良的繁殖性能, 并符合實驗動物科學(xué)的需要,即遺傳的均一性、實驗的重復(fù)性和微生物的控制性等,可望培育成國際上更為理想的實驗用小型豬品系，滿足生命科學(xué)研究、生產(chǎn)及其產(chǎn)品質(zhì)量檢驗，具有廣闊的應(yīng)用前景和優(yōu)勢[2,3,4]。
二、合作小型豬的培育與遺傳穩(wěn)定性分析
2003年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所從夏河縣等地引進2頭3-4月齡的一公一母仔豬（兄妹）和一母豬帶仔5頭（母豬約1-2歲，為全黑色；仔豬約20日齡左右，1頭為松鼠背，其余4頭為黑色或六端白），在蘭州進行異地適應(yīng)性飼養(yǎng)和觀察。按照“合作豬實驗動物化培育、近交系培育和SPF化培育”的三階段總體設(shè)想和戰(zhàn)略布局，在甘肅省科技計劃項目的支持下，蘭州獸醫(yī)研究所先后開展了“中國合作小型豬實驗動物化培育及分子遺傳特性研究”（1004TCYA001）和“近交系合作小型豬的培育及其分子遺傳特性研究”（1207TCYA025），重點對其生活習(xí)性、生長發(fā)育、繁殖性能和抗病性進行觀察，同時采用現(xiàn)代分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)和分子免疫學(xué)技術(shù)對控制其生長發(fā)育和抗病相關(guān)的關(guān)鍵分子進行分子遺傳特征研究，并對培育的合作小型豬進行免疫學(xué)基礎(chǔ)研究應(yīng)用。
（一）合作小型豬的培育
1.合作豬的馴化與適應(yīng)性培育
在原產(chǎn)地甘南藏族自治州夏河縣引進合作豬的基礎(chǔ)上，依據(jù)實驗動物學(xué)質(zhì)量控制要求，按照合作豬馴化、飼養(yǎng)和日常管理規(guī)范（草案），在異地環(huán)境（海拔1500m,溫度15～28℃）蘭州市進行適應(yīng)性舍飼飼養(yǎng)，每天2次配合飼料自由采食，全天自由飲水，追蹤性觀察和測定其生活習(xí)性、采食飲水、外貌特征、生長發(fā)育、生產(chǎn)性能以及生理生化指標變化。試驗發(fā)現(xiàn)，合作豬在飼養(yǎng)和培育到F6～7代時其野性逐漸消失，吻突變短，絨毛減少，體型鈍圓，毛色光亮，未出現(xiàn)因營養(yǎng)、環(huán)境優(yōu)越而產(chǎn)生體重、體型明顯增大的現(xiàn)象（未發(fā)表資料）。
2.近交系合作小型豬的培育
按照近交系實驗動物遺傳控制標準（甘肅省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局2018-T-106立項制定），采用“兄妹”或“父女”交配的方式進行繁殖，追蹤觀察和測定其外貌特征、生長發(fā)育、生產(chǎn)性能以及繁殖性能指標。經(jīng)封閉近交定向培育，已近交培育到F13～14代，其遺傳性狀日趨穩(wěn)定，初步建立了全黑、六端白、松鼠背和大黑白花合作小型豬4個近交家系的種群繁殖單元，總種群達50頭以上。同時，已制定并經(jīng)甘肅省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布實施了“實驗用合作小型豬繁育技術(shù)規(guī)程”（DB62/T 2897-2018）地方標準1項，以指導(dǎo)近交系合作小型豬的擴群繁殖與生產(chǎn)[5]。
3.封閉群合作小型豬培育
在建立近交系合作小型豬種群繁殖單元的基礎(chǔ)上，按照封閉群遺傳標準和要求，重點建立全黑、六端白、松鼠背3個封閉群單元作為繁殖擴大群，種群達60頭左右，生產(chǎn)提供實驗用合作小型豬800余頭，用于生長發(fā)育分子遺傳特性、免疫抗病特性以及疫苗質(zhì)量評價研究應(yīng)用，探討作為實驗動物的可行性。試驗應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，培育和生產(chǎn)的合作小型豬與商品豬相比具有遺傳背景和微生物攜帶情況清楚、基因純等特點，試驗結(jié)果均一、重復(fù)性好，適合作為感染、免疫機制以及疫苗質(zhì)量評價的靶動物模型（未發(fā)表資料）。
由于目前豬病復(fù)雜多樣，為了防止合作小型豬被自然感染以及培育SPF或非免疫近交系小型豬的需要，按照合作小型豬的遺傳和微生物質(zhì)量控制標準（甘肅省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局2018-T-106和2018-T-107立項制定），在蘭州和靜寧兩地同時進行保種、培育和擴大生產(chǎn)，且通常情況下不接種任何疫苗，這為后期SPF級小型豬的培育奠定了基礎(chǔ)。
（二）合作小型豬生長發(fā)育遺傳穩(wěn)定性分析
為探討遺傳、營養(yǎng)和環(huán)境對合作小型豬生長發(fā)育控制的影響，重點分析其染色體核型以及生長激素基因的分子組成結(jié)構(gòu)和多態(tài)性，已證實合作小型豬遺傳多態(tài)性豐富、生長發(fā)育遺傳穩(wěn)定、體型小的特性，主要由遺傳基因控制而非營養(yǎng)、氣候環(huán)境因素決定。
1.染色體核型分析
隨機無菌采集近交系合作小型豬（公、母各半）抗凝血，37℃恒溫培養(yǎng)68-72h，在終止培養(yǎng)前2-3h加入秋水仙素溶液使細胞分裂停止在中期，在顯微鏡下觀察細胞染色體的形狀、數(shù)目和核型。證實合作小型豬體細胞染色體為2n=38（母豬為XX，公豬為XY，性染色體以X、Y表示），其中常染色體18對，性染色體1對，以其他豬種相同（未發(fā)表資料）。根據(jù)染色體的相對長度、著絲點指數(shù)和臂比，將18對常染色體分為A、B、C、D 四個形態(tài)組，分別標以1～18號組成合作小型豬的染色體核型。其中A組：由1～5號5對染色體組成, 屬于近中著絲點染色體（sm）。B組：由6～7號2對染色體組成，屬于近端著絲點染色體(st)。C組：由8～12號5對染色體組成，屬于中著絲點染色體(m)。D組：由13～18號6對染色體組成，屬于末端著絲點染色體(t)。性染色體：X染色體和Y染色體均屬中著絲點染色體，X染色體的大小介于8號和9號染色體之間，Y染色體為最小的中著絲點染色體，較易辨別。
2.生長發(fā)育控制關(guān)鍵分子遺傳特征研究
生長激素是控制動物生長發(fā)育的關(guān)鍵分子，故以其生長激素基因為對象，在基因組和轉(zhuǎn)錄水平探討其分子結(jié)構(gòu)、多態(tài)性以及遺傳特征。
（1）合作小型豬生長激素功能基因與基因組結(jié)構(gòu)分析
從合作小型豬血液中提取基因組DNA，用生長激素基因參考序列設(shè)計引物，可擴增出1671bp的合作小型豬生長激素基因組序列。該基因組全長序列包含5個外顯子和4個內(nèi)含子，其中外顯子1、2、3、4和5的堿基數(shù)依次是10、161、117、162和201 bp，內(nèi)含子1、2、3和4的堿基數(shù)分別是244、210、192和277 bp，外顯子和內(nèi)含子之間的剪切序列符合GT-AG規(guī)則；合作小型豬生長激素功能基因全長651bp，推測編碼216個氨基酸的前體蛋白，成熟蛋白是一個由190個氨基酸殘基組成的分泌性蛋白。與參考序列比對，外顯子中取代和缺失的堿基數(shù)合計為4bp，內(nèi)含子中取代和缺失的堿基數(shù)合計為15bp，這說明內(nèi)含子的序列多態(tài)性大于外顯子[6,7]。
（2）合作小型豬生長激素基因序列多態(tài)性分析
為探討合作小型豬的遺傳多態(tài)性，選擇GenBank中14條豬生長激素基因序列作為參考序列，與合作小型豬的5條生長激素基因序列比較，其多態(tài)性主要表現(xiàn)在內(nèi)含子1有1個轉(zhuǎn)換和1個顛換，內(nèi)含子2有2個轉(zhuǎn)換，說明合作小型豬間的差異可能與其內(nèi)含子的關(guān)系更密切。合作小型豬與其他14 種豬之間在編碼區(qū)和非編碼區(qū)共檢測到核苷酸變異155個，其中內(nèi)含子中有119個，外顯子中有28個。在所有的核苷酸變異中，其中顛換有104個，轉(zhuǎn)換有14個，缺失有23個，插入有14個。在出現(xiàn)的堿基取代位點中，大多數(shù)是顛換型突變，顛換與轉(zhuǎn)換之比為7.43∶1，存在顛換偏移現(xiàn)象。對合作小型豬生長激素基因同源性和趨異性分析發(fā)現(xiàn)，合作小型豬與國內(nèi)其它小型豬同源性較近，與大型豬同源性較遠。15種豬生長激素基因遺傳演化分析表明，合作小型豬與Vize 豬有較遠的親緣關(guān)系，與貴州榕江香豬親緣關(guān)系最近[8,9]。
（3）合作小型豬與其它豬種群間的遺傳演化關(guān)系分析
用9個微衛(wèi)星DNA座位對5個豬群體（合作小型豬以及蘭州、武威、臨洮和青海四個雜種豬群）的125個個體的平均等位基因頻率、遺傳距離DA、標準遺傳距離Ds，主成分PC1、PC2、PC3值進行遺傳檢測。結(jié)果5個豬群體共檢測到148個等位基因，每個群體等位基因數(shù)的范圍在55～100個之間，其中青海豬群中最多為100個，合作小型豬群體中最少為55個，說明青海豬群體的多態(tài)性高，而合作小型豬群多態(tài)性小。其次，合作小型豬群體與蘭州白雜豬群體不但遺傳距離值最大(DA=0.6781)，而且標準遺傳距離DS值仍最大，達到1.3312。主成分分析顯示，PC1、PC2和PC3分別占比為62.17%、16.89%和10.94%，其中第一主成分PC1與合作小型豬有較大的正相關(guān)，與其它的呈較大的負相關(guān)，它能代表合作小型豬； 第二主成分PC2與蘭州白雜豬有較大的正相關(guān)，與其它的呈負相關(guān)，它能代表蘭州白雜豬群體；臨洮、青海和武威等三個雜種豬群體在PC1-PC2坐標中具有較近的距離，表明臨洮、青海和武威這三個雜種豬群體有相似的主成分。這說明合作小型豬群體在遺傳上遠離蘭州白雜豬群體，更遠于臨洮、青海和武威三個雜種豬群體[8,9]。
三、合作小型豬在抗病免疫分子遺傳特征研究中的應(yīng)用
機體對病原微生物感染的防御是由天然免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的，其中天然免疫在機體的非特異性抗感染免疫過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是機體抵御病原感染的第一道防線。獲得性免疫由T細胞和B細胞介導(dǎo)的針對病原成分而啟動的特異性細胞免疫和體液免疫應(yīng)答，發(fā)揮著命運決定者的作用。利用已培育的合作小型豬對其抗病免疫關(guān)鍵分子：主要組織相容性復(fù)合物（MHC）（或豬白細胞抗原SLAⅠ類和Ⅱ類分子）、T細胞抗原受體（TCRs）以及模式識別受體（PRRs）和細胞因子家族分子基因進行系統(tǒng)研究，探討其基因結(jié)構(gòu)組成、多樣性與抗病分子遺傳特征，為免疫抗病基礎(chǔ)研究提供理想的動物模型。
（一）合作小型豬天然免疫效應(yīng)分子-細胞因子研究
機體免疫系統(tǒng)的應(yīng)答程度決定了其能否阻擋病原的感染，并阻礙感染的進一步發(fā)展，而其效應(yīng)機制主要是通過高活性多功能的小分子多肽、蛋白質(zhì)或糖蛋白等細胞因子來實現(xiàn)，大多數(shù)的細胞因子以旁分泌、自分泌或內(nèi)分泌的形式發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。目前按其主要生物學(xué)功能分為白介素(IL)、干擾素（IFN）、集落刺激因子(CSF)等六大類。合作豬是適應(yīng)性和抗逆性較強的豬種，由于細胞因子是免疫抗病的主要效應(yīng)分子，因此從其抗病免疫相關(guān)的細胞因子研究入手探討合作小型豬與抗病的關(guān)系。
首先，建立了刺激誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄RT-PCR擴增法和cDNA表達文庫法克隆、發(fā)現(xiàn)抗病免疫相關(guān)細胞因子基因的技術(shù)，為高通量篩選和發(fā)現(xiàn)未知細胞因子或其它相關(guān)分子奠定了基礎(chǔ)[10]。其次，以合作小型豬為研究對象，采用誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄RT-PCR擴增法和cDNA基因文庫法技術(shù)，先后克隆、表達和鑒定分析了豬白介素家族的IL-2、4、6、12、18基因[11-17]，豬干擾素家族的IFN-α/γ基因[18,19]，集落刺激因子基因[20]，CD58基因[21]以及CD4/CD8分子基因[22-24]等；建立了動物體內(nèi)重組表達含細胞因子基因或組合的重組質(zhì)粒免疫佐劑[25-26]，先后申報專利5項，授權(quán)3項，結(jié)合其他相關(guān)研究成果獲得數(shù)項省部級科技獎勵。
（二）合作小型豬天然免疫識別分子-PPRs研究
由于模式識別受體是近20年來才發(fā)現(xiàn)和定義的與機體天然免疫最重要的、最直接的相關(guān)分子，目前已先后發(fā)現(xiàn)了TOLL樣受體（TLRs）、RIG-I樣受體（RLRs）、NOD樣受體（NLRs）、AIM2樣受體（ALRs）、C型凝集素受體（CLRs）、胞質(zhì)DNA識別受體家族如cGAS（cGAMP synthase）等，其中TLRs是在小鼠和人類上最早發(fā)現(xiàn)并研究得比較深入的家族，故在合作小型豬模式識別受體研究中以其為重點，探討其與抗病的相關(guān)性。
首先，建立了用基因組學(xué)和生物信息學(xué)方法克隆、鑒定TLRs家族基因的技術(shù)，成功先后克隆、表達和分析了豬TLR2[27,28]、TLR3[29]、TLR7/TLR8[30,31]以及接頭分子MyD88基因[33]等，明確了其分子遺傳演化關(guān)系，揭示了其與天然免疫的關(guān)系；同時克隆、表達和分析了豬cGAS、RIG-I、DHX15、DHX16等受體的分子結(jié)構(gòu)特征與模式識別抗病毒作用（未發(fā)表資料），為模式識別天然免疫分子機制研究以及免疫佐劑、抗病毒藥物的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
（三）合作小型豬獲得性免疫相關(guān)分子-MHC研究
動物機體識別自我、排除非己成分以維持其正常生理活動和抵抗疾病的能力，與其主要組織相容性復(fù)合體( MHC)密切相關(guān)，其不僅控制著機體移植排斥反應(yīng)，還參與機體對內(nèi)/外源性抗原的識別、結(jié)合，與機體獲得性免疫應(yīng)答有關(guān)。MHC分子在人類稱為HLA，在豬稱為SLA (Swine lymphocyte antigen)。其中經(jīng)典的SLAⅠ類和SLAⅡ類是其免疫相關(guān)的最重要的分子家族[34]。以合作小型豬為研究對象，并與甘肅白豬和相關(guān)物種的SLA基因作比較，重點研究其SLAⅠ類和Ⅱ類分子的基因結(jié)構(gòu)及其遺傳多態(tài)性，為抗病基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。
在國內(nèi)首次系統(tǒng)克隆和分析了豬MHCⅠ類/Ⅱ類分子中的SLA-1、SLA-2、SLA-3以及DRA/DRB、DQA/DQB的基因組13個（SLAⅠ類分子GenBank登錄號為FJ905829～FJ905834，SLAⅡ類分子為FJ905835～FJ905840）和功能基因14個（SLAⅠ類分子GenBank登錄號為FJ905817～FJ905822，SLAⅡ類分子為FJ905823～FJ905828），證實合作小型豬SLAⅠ類分子的基因組均由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成；而SLAⅡ類分子α、β鏈的外顯子和內(nèi)含子組成有差異，其中DRA和DQA由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，DQB由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成，DRB則由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成，明確了合作小型豬SLAⅠ類和Ⅱ類分子基因組的組成結(jié)構(gòu)[35,36]。
系統(tǒng)分析合作豬SLAⅠ類基因結(jié)構(gòu)的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)SLAⅠ類分子基因可分為五個功能區(qū)，其多態(tài)性位點主要集中在α1與α2結(jié)構(gòu)域，具有較多的單態(tài)性核苷酸位點（SNPs），其中核苷酸非同義置換位點數(shù)多于同義置換位點數(shù)。SLAⅠ類分子共有21個新的SNPs位點，其中SLA-1有4個，主要位于α2和α3功能區(qū)；SLA-2有6個，主要位于α1、α2和α3功能區(qū)；SLA-3有13個，主要位于α2和α3功能區(qū)。系統(tǒng)分析合作豬SLAⅡ類基因的結(jié)構(gòu)及其多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)SLAⅡ類分子基因在四個功能區(qū)的多態(tài)性位點主要集中在α1（β1）結(jié)構(gòu)域。SLAⅡ類分子共有23個SNPs位點，其中DRA有5個，DQA有6個；DQB有4個，DRB有7個。這基本明確了合作小型豬SLAⅠ類和Ⅱ類分子功能基因的多態(tài)性和遺傳特征，并針對這些遺傳特點重點分析了合作小型豬SLAⅠ類和Ⅱ類分子與抗原多肽、TCR、CD4/CD8結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)與特征，揭示了合作小型豬SLA分子與抗原多肽、TCR以及CD4/CD8多分子識別結(jié)合的特異性和復(fù)雜性[37]。
揭示了豬瘟C株疫苗免疫誘導(dǎo)PBMC的SLA等位基因優(yōu)勢選用，可能與T細胞的克隆化存在一定的相關(guān)性[38]。在豬瘟C株疫苗免疫后，實驗豬均表現(xiàn)出規(guī)律性的差異表達趨勢。其中實驗豬的SLAⅡ類基因（SLA-DQA、SLA-DQB、SLA-DRA和SLA-DRB）在第3天和第5天均表現(xiàn)為上調(diào)表達，其中第5天達到高峰約為免疫前的2-2.5倍，第9天開始回落；SLAⅠ類基因在第3天表現(xiàn)為上調(diào)表達，表達量約為免疫前1.5-2倍，第5天均回落；分別用SLA-DQA、SLA-DQB、SLA-DRA和SLA-DRB的特異性引物PCR 擴增其全長基因發(fā)現(xiàn)，基因擴增條帶單一，與目標片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。但進一步測序分析發(fā)現(xiàn)，實驗免疫豬SLA-DRA和SLA-DRB中均存在一個高頻表達的全長序列（等位基因亞型），說明豬瘟疫苗毒免疫后能促進機體SLA的表達，并產(chǎn)生抗豬瘟病毒免疫特異的反應(yīng)，且與機體抗原遞呈細胞（APC）經(jīng)受抗原刺激而活化參與T細胞免疫應(yīng)答的規(guī)律相類似，這為豬瘟新型表位肽疫苗研制提供了理論依據(jù)。
（四）合作小型豬獲得性免疫相關(guān)分子-TCR研究
T細胞受體（αβTCR）在機體獲得性細胞免疫中扮演著重要角色，但由于其基因的遺傳多樣性和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，基于病毒感染或免疫特異的豬αβT細胞克隆化增殖研究在國際上尚屬空白[39,40]。
以合作小型豬為研究對象，開展了豬TCR分子基因結(jié)構(gòu)與復(fù)雜性研究, 系統(tǒng)克隆和分析了TCRα基因108個[41]、TCRβ基因98個[42]、TCRγ基因15個和TCRδ鏈基因5個，共計226個功能分子基因，初步建立了“健康”豬αβTCR和γδTCR T細胞TCR基因庫。測序分析表明，豬α、β、γ、δ 4種TCR亞基鏈都含有信號肽區(qū)、V區(qū)、D/J區(qū)和C區(qū)基因片段，但其亞基鏈間以及同一亞基其基因序列組成都有所不同，這驗證了T細胞激活后能產(chǎn)生胚系發(fā)育和基因重排現(xiàn)象，證實了TCR基因的胚系發(fā)育、基因重排規(guī)律與其分子結(jié)構(gòu)多樣性的相關(guān)性。
成功建立了豬CD8+、CD4+的T細胞亞群TCR CDR3區(qū)基因譜型分析技術(shù)，研究了臨床健康豬TCRα、β鏈CDR3的譜型種類及多樣性。發(fā)現(xiàn)20個TRAV家族和TRBV家族在大部分αβTCR家族中表達，且其CDR3的譜型呈現(xiàn)類高斯分布，大多數(shù)含有8種以上不同長度的CDR3片段；同時，同一個體中不同TRV家族CDR3的出現(xiàn)頻次相差較大，即使同一TRV家族在不同個體中的出現(xiàn)頻次也不完全相同。這些現(xiàn)象和規(guī)律與αβT細胞胚系發(fā)育、基因重排的分子機制和多樣性特征相一致[43,44]。
首次分析了豬瘟C株疫苗毒感染特異的T細胞αβTCR表達規(guī)律及其結(jié)構(gòu)特征，明確了免疫后豬CD4+和CD8+ T 細胞TCRα鏈和β鏈多樣性與克隆化動態(tài)規(guī)律，搞清了二次免疫后呈現(xiàn)克隆性擴增的TRAV和TRBV家族CDR3序列結(jié)構(gòu)特征，為豬瘟病毒抗原肽疫苗研制和病原抗原免疫機制研究提供了依據(jù)[45]。
對克隆化的αβTCR 家族CDR3區(qū)及全長基因測序和分析發(fā)現(xiàn)，αβTCR 家族CDR3區(qū)除有經(jīng)典的分子結(jié)構(gòu)特征外，其中TRBV CDR3區(qū)還有保守的 P-A-V氨基酸基序，TRAV CDR3區(qū)也存在保守的D-D-Y氨基酸基序,而且CDR區(qū)序列完全相同的基因表達頻率較高，可達50％以上。其次，克隆化αβTCR 完全相同CDR3區(qū)的全長基因成員間的核苷酸序列相似度均在99%以上，這說明這些克隆化家族CDR3區(qū)的保守氨基酸基序可能與豬瘟病毒特異抗原肽的識別和結(jié)合有關(guān)，這為高通量篩選和開發(fā)豬瘟多肽疫苗提供了理論和技術(shù)依據(jù)[46]。
四、結(jié)論
成功異地近交培育了合作小型豬4個近交家系和3個封閉群，證實其體型小的特性，主要由遺傳基因控制而非營養(yǎng)、氣候環(huán)境因素決定。證實了合作小型豬群體內(nèi)等位基因數(shù)目少、重復(fù)次數(shù)高和遺傳穩(wěn)定，與其它豬群體間的親緣關(guān)系遠，且沒有杜洛克等西方豬血緣，是一群比較理想的獨特的高原型近交群體。合作小型豬抗病免疫關(guān)鍵分子基因分析發(fā)現(xiàn)，其具有豐富的多態(tài)性和多樣性，一方面說明合作豬具有長期適應(yīng)各種惡劣的自然環(huán)境和復(fù)雜的病原微生物環(huán)境的抗病遺傳能力，另一方面說明合作小型豬的這種遺傳特性適合用于研究復(fù)雜的免疫學(xué)現(xiàn)象與機制。
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