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美鳳力臨床前大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心

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動(dòng)物行為學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法及評(píng)分方法

動(dòng)物行為實(shí)驗(yàn)由于是動(dòng)物整體生理和心理狀態(tài)綜合、全面和實(shí)時(shí)效應(yīng)的反應(yīng),被認(rèn)為是人類疾病表現(xiàn)和發(fā)病機(jī)制研究,新藥發(fā)現(xiàn)、安全和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)分析的基本實(shí)驗(yàn)手段,在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生命科學(xué)和軍事醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域具有不可替代的地位和作用,越來(lái)越受到國(guó)際科學(xué)界的廣泛重視。

動(dòng)物行為實(shí)驗(yàn)方法(experimental methodology based on animal behavior research)是動(dòng)物行為學(xué)的重要內(nèi)容,是融合動(dòng)物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生物學(xué)、電子工程、計(jì)算機(jī)和信息等多學(xué)科的基礎(chǔ)理論、技術(shù)和方法,以正常和(或)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為對(duì)象,在自然界或?qū)嶒?yàn)室內(nèi),以觀察和實(shí)驗(yàn)方式對(duì)動(dòng)物的行為信息進(jìn)行采集、分析和處理,將其實(shí)驗(yàn)結(jié)果類比和推演到人,研究其行為信息的生理和病理意義的新興學(xué)科。

接下來(lái)主要從模型評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)方法和評(píng)分方法兩個(gè)方面進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。

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一、行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法
01

學(xué)習(xí)及記憶能力

學(xué)習(xí)記憶功能異常是絕大多數(shù)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床特征,如阿爾茨海默癥,帕金森病,癲癇,精神分裂,腦癱,腦卒中等。

學(xué)習(xí)是神經(jīng)系統(tǒng)接受外界環(huán)境變化獲得新行為和經(jīng)驗(yàn)的過(guò)程,記憶是指對(duì)學(xué)習(xí)獲得的經(jīng)驗(yàn)或行為的保持,包括獲得、鞏固、再現(xiàn)及再鞏固四個(gè)環(huán)節(jié)。學(xué)習(xí)和記憶二者是互相聯(lián)系的神經(jīng)活動(dòng)過(guò)程??捎脕?lái)評(píng)估小鼠的學(xué)習(xí)能力、記憶能力,可通過(guò)橫向、縱向比較獲得不同變量影響下或不同時(shí)期的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

① Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn):通過(guò)測(cè)定不同入水點(diǎn)下實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尋找并爬上平臺(tái)所需要的時(shí)間,是一種評(píng)價(jià)擬癡呆動(dòng)物模型的理想方法,用于評(píng)價(jià)動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶能力。

② 空間搜索實(shí)驗(yàn):依次從一、二、三象限入水點(diǎn)將動(dòng)物放入水中,分別 3 次記錄動(dòng)物 90 s 內(nèi)在目標(biāo)象限的游泳時(shí)間(第四象限),有效區(qū)停留時(shí)間、經(jīng)過(guò)站臺(tái)次數(shù)、經(jīng)過(guò)有效區(qū)次數(shù)。多用于反應(yīng)動(dòng)物對(duì)事物記憶的保持能力。

③ 探孔實(shí)驗(yàn):將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放于探孔板(4×4 排列)的中心,記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在 3、4、5 min 時(shí)將頭深入探孔中的次數(shù)。為評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本探索能力的檢測(cè)。又稱洞板實(shí)驗(yàn),是基于小鼠具有探洞的天性,從而評(píng)價(jià)其對(duì)新環(huán)境的探索能力。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)及反復(fù)進(jìn)入洞板儀次數(shù)的增多探洞次數(shù)明顯減少,從而產(chǎn)生適應(yīng)性的特點(diǎn),洞板實(shí)驗(yàn)也曾被一些學(xué)者應(yīng)用于評(píng)價(jià)對(duì)于小鼠的記憶力。

④ 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn):給予箱底連續(xù) 5 min 的交流電刺激,記錄每只大鼠收到電擊后跳上平臺(tái)的次數(shù),此為正常的躲避傷害性刺激的反應(yīng)。將大鼠跳上平臺(tái)的次數(shù)作為學(xué)習(xí)成績(jī)。24 h 后重新實(shí)驗(yàn),在通電的情況下,直接將大鼠置于平臺(tái)上,記錄其第一次跳下平臺(tái)的潛伏期和 5 min 內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)作為記憶的成績(jī)。常用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的記憶能力。

⑤ Y 形迷宮實(shí)驗(yàn):給予溫和的足部電擊,行為反應(yīng)為動(dòng)物逃避曾經(jīng)遭受過(guò)電擊刺激的地方,以每只大鼠受到電擊的次數(shù)作為學(xué)習(xí)成績(jī),24 h 后重新測(cè)試時(shí)的潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)則作為記憶的成績(jī)。能夠簡(jiǎn)便的對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。

⑥ 被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn):第 1 天將動(dòng)物放入有照明的箱內(nèi),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物會(huì)通過(guò)小門進(jìn)入暗箱,讓其滯留于暗箱中 30 s 后放回籠中。第 2 天同第 1 天,但是待其在暗箱中時(shí),給予足底電擊,持續(xù) 1.5 s 后取出動(dòng)物。第 3 天時(shí)記錄動(dòng)物從照明箱進(jìn)入暗箱的延遲時(shí)間。延遲的時(shí)間越長(zhǎng),代表其學(xué)習(xí)能力越好。

02
耐力及運(yùn)動(dòng)能力

運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)檢測(cè)的重要內(nèi)容。動(dòng)物的每一種行為學(xué)檢測(cè)方法都需要?jiǎng)游镞M(jìn)行運(yùn)動(dòng)。另外,運(yùn)動(dòng)功能障礙也是帕金森病、腦缺血等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要臨床表現(xiàn)。

運(yùn)動(dòng)行為實(shí)驗(yàn)方法包括:

(1)一般運(yùn)動(dòng)行為學(xué)評(píng)價(jià),如曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn);

(2)協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)評(píng)價(jià)如滾軸、平衡木實(shí)驗(yàn)等;

(3)肌力評(píng)價(jià)如握力實(shí)驗(yàn);

(4)耐力行為學(xué)評(píng)價(jià),如負(fù)重游泳、跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)等。

① 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在轉(zhuǎn)棒儀器上以4 r/min的速度適應(yīng) 10 min 后,休息 30 min,以勻速 10 min 內(nèi)4~40 r/min,記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物掉下的速度和轉(zhuǎn)棒上保持的時(shí)間,用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)能力。

② 采用踏步實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)動(dòng)物沿著柵格移動(dòng)時(shí),前肢或后肢踩空,記錄為一次錯(cuò)誤。正常的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,精細(xì)運(yùn)動(dòng)能力較好,踩空次數(shù)較少。而在缺血中風(fēng)模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中,踩空次數(shù)發(fā)生較多。檢測(cè)時(shí),動(dòng)物從一端放入,記錄 100 步所用時(shí)間、發(fā)生錯(cuò)誤次數(shù)。

③ 跑步機(jī)實(shí)驗(yàn):將小鼠置于動(dòng)物用跑步機(jī)上,在跑步機(jī)后部給予電擊。如果動(dòng)物在后方點(diǎn)擊區(qū)域的停留時(shí)間超過(guò) 4 s,反應(yīng)為動(dòng)物力竭。記錄動(dòng)物跑動(dòng)的最長(zhǎng)時(shí)間及受電擊次數(shù)。動(dòng)物耐力用單位時(shí)間內(nèi)受電擊的次數(shù)表示。

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03
協(xié)調(diào)能力

① 平衡棒實(shí)驗(yàn):采用兩個(gè)平行棒(直徑 1 cm,長(zhǎng)115 cm,間距 2.5 cm),末端與平臺(tái)(15 cm×50 cm)相連接,記錄雙后肢位于平行杠上的時(shí)間,一側(cè)后肢掉下或者摔倒、搖擺等情況。記錄每分鐘每米的錯(cuò)誤次數(shù)。用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后肢的協(xié)調(diào)能力。

② 爬桿實(shí)驗(yàn):將小鼠放在棒的頂端,頭部向下,使小鼠自然向下爬行。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下:

0 級(jí):一步步向下爬;

1 級(jí):向下滑行;

2 級(jí):不能抓住棒;

3 級(jí):翻正反射消失。則是用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物協(xié)調(diào)性的實(shí)驗(yàn)。

04
自發(fā)活動(dòng)能力

① 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn):將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放入25 cm×25 cm×25 cm 的空箱,與曠場(chǎng)中央放入單只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,予自由活動(dòng) 10 min。試驗(yàn)后噴灑酒精消除味道,進(jìn)行下一只動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)。分析實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在中央?yún)^(qū)域和周邊區(qū)域的活動(dòng)距離和時(shí)間。用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)情況。

② 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn):由兩條開臂和兩條閉臂組成,呈相互垂直“十”字形,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物頭朝開臂,放入其中,予自由活動(dòng) 5 min,分析小鼠進(jìn)入開臂和閉臂的時(shí)間及次數(shù)。用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)于新奇環(huán)境的焦慮反應(yīng)。

③ Lat 實(shí)驗(yàn):為給予大鼠一個(gè)視覺空間注意目標(biāo),分別記錄大鼠穿越角落的頻數(shù)(自發(fā)活動(dòng)水平),直立和斜搭在墻上的頻率(非選擇性注意的水平)。Lat 迷宮實(shí)驗(yàn)在大鼠自發(fā)活動(dòng)及非選擇性注意水平的評(píng)價(jià)中可靠性非常高,已經(jīng)成為有關(guān)注意缺陷疾病的常用模型之一。

05
動(dòng)物情志活動(dòng)能力

由于動(dòng)物的情緒體驗(yàn)難以用語(yǔ)言表達(dá),行為實(shí)驗(yàn)是其主要的評(píng)價(jià)方法。實(shí)驗(yàn)方法主要包括強(qiáng)迫游泳、懸尾、糖水偏愛、獲得性無(wú)助、高架十字迷宮、曠場(chǎng)、明暗箱實(shí)驗(yàn)等

① 糖水?dāng)z取實(shí)驗(yàn):對(duì)大鼠進(jìn)行 24 h 禁水后,在背景安靜的房間內(nèi)給予大鼠 2 瓶水,分別為1% 蔗糖水和純水,稱重。2 h 后再次稱重,計(jì)算動(dòng)物的糖水消耗率,糖水偏愛率 = 糖水消耗 / 總液體消耗 ×100%。通常用于動(dòng)物情志活動(dòng)的評(píng)價(jià)。

② 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn):將單只小鼠放入水深為10 cm的燒杯中,燒杯 20 cm×14 cm。水溫(24±2)℃,觀察 6 min,計(jì)算后 4 min 中內(nèi)小鼠強(qiáng)迫游泳時(shí)不動(dòng)時(shí)間。多用于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否處于“絕望行為”狀態(tài)。動(dòng)物在最初入水時(shí),會(huì)表現(xiàn)出掙扎、逃脫及游動(dòng)。當(dāng)感受到為不可逃脫后,變回采取將頭部露出水面、肢體保持不動(dòng)的漂浮狀態(tài)。保持不動(dòng)的狀態(tài)被稱為“絕望行為”。常常用于對(duì)抑郁癥模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。

③ 懸吊實(shí)驗(yàn):安靜、避光下,將大鼠尾部根部 1/3 處固定于懸尾實(shí)驗(yàn)架上,頭向下,分別觀察不動(dòng)時(shí)間、掙扎次數(shù)。觀察 5 min。常作為抗抑郁藥初篩及抑郁癥模型行為學(xué)檢測(cè)的輔助評(píng)價(jià)指標(biāo)。產(chǎn)后抑郁癥動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn):采用對(duì)受孕母鼠分組進(jìn)行地塞米松(第 1 天起)、地塞米松(第 15 天起)、生理鹽水組,分別觀察產(chǎn)后母鼠對(duì)幼崽的關(guān)愛行為和自身積極與消極行為。

關(guān)愛行為:噙崽潛伏期、集窩時(shí)間、舔崽時(shí)間、筑巢時(shí)間、噙崽頻率。

積極行為:母鼠站立、大步走動(dòng)、攀越、頂撞鼠籠。

消極行為:母鼠將頭部埋于身體下部,頻繁無(wú)方向無(wú)目的的翻動(dòng)墊料,后頭、尾、爪不停騷動(dòng)的總時(shí)間。用于評(píng)價(jià)母鼠對(duì)幼崽的關(guān)愛行為和自身積極與消極行為。

06
機(jī)體疼痛及反射能力

① 咬肌和顳肌機(jī)械性痛覺敏感性的測(cè)量實(shí)驗(yàn):動(dòng)物安靜、放松下輕靠在測(cè)量者手心,測(cè)量點(diǎn)位于眼耳連線中點(diǎn),向下 10 mm 為咬肌的測(cè)量點(diǎn)。采用從小到大標(biāo)號(hào)的尼龍毛,給組織施加不同壓力。觀察動(dòng)物有無(wú)縮頭、抬腿、避開、發(fā)出聲音等陽(yáng)性反應(yīng)。記錄反應(yīng)次數(shù)和相對(duì)應(yīng)的尼龍毛編標(biāo)號(hào)。另有研究根據(jù)臨床接受正畸治療患者的疼痛程度主要影響進(jìn)食量的實(shí)驗(yàn),采用記錄大鼠每天 24 h 的飲食量、飲水量、體重的方法對(duì) OP(正畸性痛)進(jìn)行疼痛的定量評(píng)價(jià)。

② 椎間盤源性下腰痛動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn):觀察術(shù)后,大鼠的 9 種不同行為學(xué),靜止不動(dòng)、微動(dòng)、運(yùn)動(dòng)、靜止時(shí)抬足、微動(dòng)時(shí)抬足、運(yùn)動(dòng)時(shí)抬足、清理皮毛、后腿站立、屈身,通常用于對(duì)動(dòng)物腰痛疾病模型的評(píng)價(jià)。

③ 機(jī)械刺激縮足反射閾值實(shí)驗(yàn):采用 16 個(gè)強(qiáng)度不同的刺激,從小到大,分別刺激大鼠兩側(cè)足底中心位置,每個(gè)強(qiáng)度 10 次。將大鼠出現(xiàn) 5 次以上的縮足反應(yīng)強(qiáng)度定為對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)閾值,能夠測(cè)量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)閾值。

④ 熱刺激反射縮足潛伏期實(shí)驗(yàn):采用熱刺激儀器,使大鼠的足底落在照射光圈內(nèi),直徑為 5 mm,記錄從開始照射至大鼠出現(xiàn)縮足逃避反射的時(shí)間,此即為熱刺激反應(yīng)潛伏期。

⑤ 飲水抑制的耳鳴動(dòng)物行為學(xué)模型實(shí)驗(yàn):采用部分剝奪飲水的動(dòng)物放入有持續(xù)噪音的背景中,并把噪音的停止與給予電擊相結(jié)合,使動(dòng)物意識(shí)到噪音停止是危險(xiǎn)的,從而主動(dòng)抑制添水。建立“噪音停止—添水動(dòng)作減少”的條件反射。多用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否發(fā)生了耳鳴。

二、行為學(xué)評(píng)分方法
Racine 標(biāo)準(zhǔn):對(duì)癲癇小鼠的發(fā)作進(jìn)行分級(jí)。

0 級(jí):無(wú)反應(yīng);

Ⅰ級(jí):節(jié)律性嘴或者面部抽動(dòng);

Ⅱ級(jí):點(diǎn)頭或者甩尾;

Ⅲ級(jí):?jiǎn)沃閯?dòng);

Ⅳ級(jí):多肢抽動(dòng)或者強(qiáng)直;

Ⅴ級(jí):全面強(qiáng)直陣攣發(fā)作。

分別記錄小鼠發(fā)作的潛伏期、發(fā)作程度分級(jí)、輕度發(fā)作(Ⅰ ~ Ⅲ)次數(shù)、重度發(fā)作(Ⅳ ~ Ⅴ)次數(shù)。

Longa 評(píng)分法:常用于腦出血及腦梗死動(dòng)物模型評(píng)價(jià)。

0 分:無(wú)神經(jīng)損傷癥狀;

1 分:不能完全伸展手術(shù)對(duì)側(cè)前爪或后爪;

2 分:行走時(shí),向手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈;

3 分:行走時(shí),向手術(shù)對(duì)側(cè)傾倒;

4 分:不能自發(fā)行走,意識(shí)喪失。

Bederson 評(píng)分:常用于腦出血及腦梗死動(dòng)物模型評(píng)價(jià)。

0 分:無(wú)神經(jīng)功能缺損;

1 分:前肢出現(xiàn)任何屈曲成分,不伴其他不正常;

2 分:側(cè)推抵抗力下降,伴前肢屈曲,無(wú)轉(zhuǎn)圈行為;

3 分:同 2 級(jí)行為,伴自發(fā)性旋轉(zhuǎn)。

肢體對(duì)稱實(shí)驗(yàn)評(píng)分:將大鼠置于網(wǎng)中,網(wǎng)眼大小為 2.3 cm×2.3 cm,當(dāng)大鼠在網(wǎng)格中行走時(shí),計(jì)數(shù)在 2 min 內(nèi)其前爪漏到網(wǎng)眼中的次數(shù),即錯(cuò)步數(shù)。

計(jì)算公式:(腦病變對(duì)側(cè)前爪的錯(cuò)步數(shù) - 病變同側(cè)前爪的錯(cuò)步數(shù))/ 總步數(shù)。其分值如為正數(shù)表明腦病變對(duì)側(cè)功能缺損,如為負(fù)數(shù)表明腦病變同側(cè)功能缺損。

暗盒實(shí)驗(yàn):對(duì)動(dòng)物行為進(jìn)行評(píng)分,良好 0~3分;一般:4~6 分;差:7~10 分。并觀察糞便的粒數(shù)。糞便粒數(shù)反應(yīng)其緊張的程度。

行為學(xué)觀察包括:抓取時(shí)的反應(yīng)、進(jìn)入暗盒時(shí)的反應(yīng)、進(jìn)入暗盒后的反應(yīng)、開暗盒時(shí)的反應(yīng)、回飼養(yǎng)籠的反應(yīng)。

小型豬腦缺血模型神經(jīng)功能缺失評(píng)分:每頭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在術(shù)后 3 h、6 h、12 h、1~7 d 進(jìn)行改良的神經(jīng)功能缺失評(píng)分??偡譃?25 分,包括食欲(4 分)、站姿(5 分)、頭部位置(2 分)、發(fā)聲(2 分)、步態(tài)(3 分)、運(yùn)動(dòng)功能(前肢 / 后肢,4×2 分)以及面癱(1 分)。

憤怒行為實(shí)驗(yàn),憤怒行為檢測(cè):①搏斗次數(shù);②威嚇次數(shù);③攀壓次數(shù);④勝利次數(shù);⑤失敗次數(shù)。

行為學(xué)得分 = ① + ② + ③ + ④ - ⑤。是通過(guò)各項(xiàng)目相加所得總分,來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物憤怒模型的方法。

結(jié)語(yǔ):

從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)階段開始,便要通過(guò)動(dòng)物行為來(lái)觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康情況,通過(guò)給藥、手術(shù)及其他干預(yù)措施制作動(dòng)物模型,無(wú)論是制作西醫(yī)的疾病模型,還是中醫(yī)證候模型的復(fù)制,動(dòng)物行為學(xué)始終貫穿于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的整體之中。對(duì)于動(dòng)物學(xué)家來(lái)說(shuō),無(wú)論是基礎(chǔ)還是應(yīng)用研究,正確的設(shè)計(jì)和執(zhí)行都是實(shí)驗(yàn)所必要的。

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