早發(fā)性卵巢功能不全（Premature Ovarian Insufficiency，POI）是指女性在40歲以前出現(xiàn)卵巢功能衰退，是女性不孕的主要原因之一。POI患者促性腺激素水平升高（促卵泡生成素>25 U/L）、雌激素水平下降，主要表現(xiàn)為月經(jīng)異常（稀發(fā)或閉經(jīng)），誘發(fā)更年期癥狀，如潮熱、盜汗、失眠等，增加心血管疾病和骨密度降低的風(fēng)險(xiǎn)。有研究表明，POI在我國(guó)的發(fā)病率約1%，其受到遺傳、免疫、化療等醫(yī)源性因素、環(huán)境、心理因素的影響，發(fā)病率逐年增長(zhǎng)且患病群體年輕化。目前，POI發(fā)病機(jī)制還不明確，缺乏有效的治療手段和藥物，因此，找到安全且有效的治療方案成為亟待解決的問題。建立動(dòng)物模型是研究發(fā)病機(jī)制及治療效果的常用方法，根據(jù)不同的發(fā)病機(jī)制，POI的動(dòng)物模型制備方法主要有化學(xué)損傷藥物造模法、半乳糖代謝造模法、基因敲除造模法等。化療損傷藥物模型是研究POI的經(jīng)典模型?；熕幬锃h(huán)磷酰胺造價(jià)低，可用于治療惡性腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病綜合征等。環(huán)磷酰胺通過促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡并對(duì)不同發(fā)育階段的卵泡造成損傷，使卵泡發(fā)育受阻，引起性激素水平變化，進(jìn)而導(dǎo)致卵巢功能障礙。通過比較不同劑量的環(huán)磷酰胺對(duì)新西蘭白兔卵巢功能的影響，探究建立化療損傷性POI家兔模型的最佳給藥方案，以期為臨床研究提供一種安全、可靠的模型構(gòu)建方案。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
普通級(jí)雌性未交配新西蘭白兔32只，5月齡，體質(zhì)量2.7～2.9 kg，給予全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料，保持室溫在20℃～24℃，相對(duì)濕度在45%～50%，模擬正常晝夜生理節(jié)律，每天光照12 h，自由飲水和進(jìn)食。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照本院實(shí)驗(yàn)中心的規(guī)范要求。
主要試劑及設(shè)備
注射用環(huán)磷酰胺購(gòu)自德國(guó)Baxter Oncology GmbH公司，0.2 g/瓶，注射前用生理鹽水配成40 mg/ml新鮮水溶液備用；兔雌二醇酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、兔促卵泡生成素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海江萊生物;烏拉坦購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司（貨號(hào)U820333）;蛋白提取試劑盒Protein Ext Mammalian Total Protein Extraction Kit購(gòu)自全式金公司（貨號(hào)DE101-01）;BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自天根公司（貨號(hào)PA115）;Bax、Bcl2、Tubulin蛋白抗體均購(gòu)自Proteintech公司（貨號(hào)50599-2-lg、12789-1-AP、11224-1-AP）;Goat HRP anti-Mouse購(gòu)自invitrogen公司（貨號(hào)31460）;BY-600A型離心機(jī)購(gòu)自北京白洋醫(yī)療器械有限公司；Leica RM225切片機(jī)、Leica EG1150包埋機(jī)均購(gòu)自德國(guó)Leica Biosysterms Nussloch GmbH公司；BX51顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳槽購(gòu)自日本Bio-craft（貨號(hào)BE-230）;半干轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad。
動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)干預(yù)
根據(jù)臨床上環(huán)磷酰胺化療的用藥方案，分為小劑量持續(xù)治療組和大劑量沖擊治療組，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將32只新西蘭兔分成4組，每組各8只。A組為正常對(duì)照組；B組50 mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺1 d，8 mg/kg連續(xù)注射14 d; C組50 mg/kg連續(xù)腹腔注射環(huán)磷酰胺3 d; D組100 mg/kg連續(xù)腹腔注射環(huán)磷酰胺3 d。模型組家兔雌二醇水平降低、促卵泡生成素升高且與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），卵巢卵泡數(shù)目顯著減少表明POI模型構(gòu)建成功。
動(dòng)物取材及處理
各組家兔造模3周后，耳緣靜脈取血，收集于5 ml采血管中。隨后經(jīng)耳緣靜脈注射過量20%烏拉坦溶液致兔安樂死，取家兔雙側(cè)卵巢，一側(cè)卵巢置于凍存管中，置于-80℃冰箱凍存，另一側(cè)卵巢放入10%中性甲醛溶液中固定至少24 h。血液標(biāo)本室溫下靜置2 h后，3 000 r/min離心10 min，將上層血清分裝至1.5 ml離心管，每管300 μl，置于-80℃冰箱保存。
家兔體質(zhì)量及卵巢指數(shù)
造模開始后，觀察家兔的活動(dòng)情況、進(jìn)食量及兔毛脫落情況。每周對(duì)家兔進(jìn)行稱重并記錄，造模結(jié)束后，取兩側(cè)卵巢，小心剝離多余脂肪組織，測(cè)量卵巢長(zhǎng)徑并用電子天平稱濕重，計(jì)算卵巢指數(shù)。
卵巢指數(shù)=（卵巢濕重/體質(zhì)量）×100%
卵巢組織學(xué)形態(tài)及卵泡數(shù)目
卵巢組織經(jīng)10%中性甲醛溶液固定后，進(jìn)行石蠟包埋，切成4 μm切片，HE染色后，在光鏡下觀察卵巢組織形態(tài)，計(jì)數(shù)各級(jí)卵泡，計(jì)算閉鎖卵泡/卵泡總數(shù)的比值（閉鎖卵泡占比）。原始卵泡定義為卵母細(xì)胞被一層鱗狀顆粒細(xì)胞包圍；初級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞被一層立方顆粒細(xì)胞包圍；次級(jí)卵泡由一層以上的立方顆粒細(xì)胞包圍，尚未形成囊腔；早期的竇卵泡開始出現(xiàn)囊腔，排卵前的竇卵泡出現(xiàn)明顯的層級(jí)云顆粒細(xì)胞層；閉鎖卵泡的卵母細(xì)胞萎縮，形態(tài)不規(guī)則，透明帶深染。
血清激素水平檢測(cè)
血清樣本采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)促卵泡生成素、雌二醇的水平，按照試劑盒說明書操作。
（1）標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋。
（2）加樣：分別設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。加樣體積為50 μl，樣品使用樣品稀釋液稀釋5倍加樣。
（3）每孔加入50 μl Biotin-抗體工作液。
（4）37℃溫浴1 h后洗滌。
（5）加酶：每孔加入100 μl酶結(jié)合物工作液，37℃溫浴30 min后洗滌。
（6）顯色：加入底物（TMB）90 μl，37℃避光溫浴30 min。
（7）終止：每孔加入50 μl終止液。（8）在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔的吸光度值。
討論
卵巢功能衰退是一種常見的婦科內(nèi)分泌疾病，常引起原發(fā)或繼發(fā)不孕、低雌激素癥狀，如潮熱、多汗、性欲減退等，不僅會(huì)引起女性生殖內(nèi)分泌功能障礙，還嚴(yán)重影響育齡婦女的身心健康和生活質(zhì)量。POI是卵巢早衰的早期階段，如果在卵巢損傷更嚴(yán)重之前實(shí)施有效的治療措施，能夠避免或延緩卵巢早衰的發(fā)生。
建立穩(wěn)定的動(dòng)物模型是治療研究的重要前提，目前，實(shí)驗(yàn)研究采用各種方法造模。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，切除新生小鼠的胸腺后，絕大多數(shù)的小鼠出現(xiàn)自身免疫性卵巢炎癥及卵巢早衰。在使用D-半乳糖建立卵巢早衰模型時(shí)，小鼠動(dòng)情周期出現(xiàn)紊亂，卵泡減少，與臨床患者卵泡丟失、閉鎖、不排卵癥狀相符。有研究表明，敲除小鼠PTEN基因后，小鼠原始卵泡減少，促卵泡生成素激素水平升高。有研究通過腹腔注射環(huán)磷酰胺建立POI大鼠模型，單次注射50 mg/kg后、每天8 mg/kg連續(xù)注射8 d得到了理想模型，大鼠卵巢功能明顯衰退，卵巢組織學(xué)及內(nèi)分泌變化均最接近臨床卵巢早衰患者。
大多數(shù)研究選用大鼠或小鼠建立動(dòng)物模型，本研究使用新西蘭白兔模擬化療藥物損傷卵巢模型，因?yàn)榧彝寐殉步M織更大，各級(jí)卵泡數(shù)量更多，卵母細(xì)胞更接近人類的大小。耳緣靜脈采血方便，對(duì)動(dòng)物損傷小，符合動(dòng)物倫理學(xué)要求，還可進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)激素水平的監(jiān)測(cè)。本研究通過3種不同的給藥劑量建立POI模型，相較于A組，B組家兔原始和初級(jí)卵泡數(shù)量減少，閉鎖卵泡數(shù)量增多，但體質(zhì)量、卵巢長(zhǎng)徑、卵巢指數(shù)、激素水平、各級(jí)卵泡數(shù)量變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明這種給藥劑量對(duì)家兔整體影響較小，對(duì)卵巢的破壞較輕，無法用于建模。C組兔毛部分脫落，體質(zhì)量下降較為平穩(wěn)，卵巢受損嚴(yán)重，卵巢指數(shù)、卵泡數(shù)量、雌二醇和促卵泡生成素激素水平與A組比較差異明顯，更加符合POI的自然變化情況，更適宜建立POI模型。D組家兔卵巢受損情況嚴(yán)重，雖然激素水平、卵泡數(shù)量與A組具有顯著差異，但家兔狀態(tài)較差，進(jìn)食量少，兔毛脫落嚴(yán)重，耐受性差，不適合用于造模進(jìn)行后續(xù)研究。
綜上所述，50 mg/kg連續(xù)腹腔注射環(huán)磷酰胺3 d是建立化療損傷性POI家兔模型的最佳濃度，該方法簡(jiǎn)便易行，卵巢損傷較穩(wěn)定，動(dòng)物耐受性好，能夠用于評(píng)估POI不同治療方案的預(yù)后效果，為臨床研究提供理論支持。
Source: 臨床軍醫(yī)雜志. 2024, 52 (01)，醫(yī)源性因素早發(fā)性卵巢功能不全家兔模型建立，DOI:
17312606166