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美鳳力臨床前大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心
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盡管血小板是一種無(wú)核血細(xì)胞，但它們擁有線(xiàn)粒體。線(xiàn)粒體含有DNA，被兩個(gè)脂質(zhì)雙層膜包圍[1]。線(xiàn)粒體作為細(xì)胞的動(dòng)力源，參與調(diào)控血小板新陳代謝、ATP產(chǎn)生、血小板活化和細(xì)胞凋亡[2,3]。在正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞DNA和核苷酸庫(kù)不斷暴露于活性氧（ROS），從而發(fā)生氧化損傷，導(dǎo)致氧化核苷酸的生成[4]。Human MutT Homolog 1（MTH1）是一種核苷酸焦磷酸酶，可水解氧化的核苷酸，參與DNA損傷修復(fù)過(guò)程[5]。但關(guān)于MTH1在血小板中的表達(dá)和功能作用尚不清楚。 2023年8月10日，徐州醫(yī)科大學(xué)血液病研究所喬建林/徐開(kāi)林/曾令宇團(tuán)隊(duì)在《Nature Communications》上發(fā)表了題為“MTH1 protects platelet mitochondria from oxidative damage and regulates platelet function and thrombosis”的研究論文，揭示了血小板線(xiàn)粒體氧化損傷修復(fù)的新機(jī)制[6]。碩士研究生丁洋洋、桂翔和褚翔為論文共同第一作者，喬建林教授、徐開(kāi)林教授和曾令宇教授為論文共同通訊作者。 圖片來(lái)源：《Nature Communications》 研究材料 MTH1flox/flox小鼠（賽業(yè)生物定制）、PF4-CRE小鼠和野生型小鼠 研究方法 流式細(xì)胞術(shù)、動(dòng)脈血栓模型，深靜脈血栓模型、出血模型、蛋白印跡、定量磷酸化蛋白組學(xué)、免疫熒光等。 技術(shù)路線(xiàn) 01MTH1fl/fl和MTH1fl/fl PF4-Cre小鼠 02體內(nèi)出血和血栓模型 03體外血小板功能檢測(cè) 04體外血小板線(xiàn)粒體氧化損傷檢測(cè) 05定量磷酸化蛋白組學(xué)檢測(cè)差異蛋白磷酸化 06檢測(cè)線(xiàn)粒體基因編碼蛋白表達(dá) 研究結(jié)果 1.血小板表達(dá)MTH1，且其缺失顯著抑制血小板參與體內(nèi)止血和血栓形成 為探索MTH1是否在血小板內(nèi)表達(dá)，研究人員使用不同抗體及免疫電鏡證實(shí)MTH1在血小板內(nèi)表達(dá)，且定位在線(xiàn)粒體中（圖1）。為進(jìn)一步研究其在血小板功能和血栓形成中的作用，研究人員使用賽業(yè)生物定制MTH1flox/flox小鼠構(gòu)建了巨核細(xì)胞/血小板特異性MTH1敲基因小鼠，發(fā)現(xiàn)血小板MTH1缺失小鼠體內(nèi)止血和動(dòng)靜脈血栓形成顯著受損。 圖1 MTH1在血小板中的表達(dá)及在止血和血栓中的作用[6] 2.MTH1敲除顯著抑制GPCR介導(dǎo)的血小板聚集、鈣動(dòng)員和線(xiàn)粒體ATP產(chǎn)生 為探索MTH1對(duì)體外血小板功能的影響，研究者分離血小板，使用不用激活劑來(lái)刺激血小板，發(fā)現(xiàn)，MTH1缺失顯著降低了凝血酶（GPCR受體的激動(dòng)劑）介導(dǎo)的血小板活化、聚集能力、鈣離子動(dòng)員、促凝活性和線(xiàn)粒體ATP產(chǎn)生（圖2），但不影響膠原相關(guān)多肽（CRP）（GPVI受體的激動(dòng)劑）介導(dǎo)的血小板功能。 圖2 MTH1對(duì)血小板聚集、顆粒釋放、aIIbb3活化、鈣動(dòng)員和線(xiàn)粒體ATP的影響[6] 3.MTH1缺失顯著增加血小板活化后線(xiàn)粒體的氧化損傷 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，MTH1缺失顯著增加了凝血酶而不是 CRP誘導(dǎo)的血小板線(xiàn)粒體氧化損傷。其原因是凝血酶而不是CRP可誘導(dǎo)血小板線(xiàn)粒體ROS產(chǎn)生，進(jìn)而引起線(xiàn)粒體氧化損傷（圖3）。 圖3 MTH1對(duì)血小板線(xiàn)粒體氧化損傷的影響[6] 4.MTH1敲除影響血小板活化后眾多蛋白的磷酸化 為進(jìn)一步探索MTH1對(duì)血小板信號(hào)通路的影響，研究者進(jìn)行了定量磷酸化蛋白組學(xué)分析，鑒定到多種具有顯著差異的磷酸化蛋白，KEGG分析發(fā)現(xiàn)這些差異的磷酸化蛋白主要富集在血小板活化、MAPK和Rap1信號(hào)通路。此外，顯著差異的磷酸化蛋白中有2個(gè)定位于線(xiàn)粒體，一個(gè)參與調(diào)控線(xiàn)粒體代謝（Slc25a1），另一個(gè)參與調(diào)控線(xiàn)粒體蛋白合成（Slirp）（圖4）。 圖4 定量磷酸化蛋白組學(xué)分析[6] 5.MTH1敲除顯著下調(diào)MT-CO1的表達(dá) 由于MTH1參與DNA氧化損傷，其缺失可能影響DNA的轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯和合成等，研究人員接下來(lái)檢測(cè)了MTH1缺失對(duì)線(xiàn)粒體蛋白合成和表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)線(xiàn)粒體基因編碼的蛋白MT-CO1（細(xì)胞色素C氧化酶I，線(xiàn)粒體氧化呼吸鏈復(fù)合物4的主要亞基）的蛋白和基因表達(dá)水平在刺激后的MTH1敲除血小板中顯著降低（圖5），而核基因組編碼的蛋白表達(dá)水平并未顯著改變。MT-CO1表達(dá)的降低主要原因是在所有線(xiàn)粒體DNA中，MT-CO1基因中G堿基含量最高，而MTH1的主要功能參與修復(fù)氧化的G堿基，這樣將導(dǎo)致MTH1缺失后無(wú)法修復(fù)氧化的堿基，進(jìn)而使MT-CO1的表達(dá)顯著降低。 圖5 MTH1敲除后引起MT-CO1水平的降低[6] 6.MTH1在人血小板中發(fā)揮相同作用 為驗(yàn)證MTH1是否在人血小板發(fā)揮相同作用，研究者使用了MTH1抑制劑TH588，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制人血小板MTH1顯著降低了凝血酶而不是CRP誘導(dǎo)的血小板功能。此外，抑制人血小板MTH1顯著增加了凝血酶誘導(dǎo)的血小板線(xiàn)粒體氧化損傷（圖6）。 圖6 MTH1在人血小板功能中的作用[6] 
研究結(jié)論
本研究利用巨核細(xì)胞/血小板特異性MTH1敲基因小鼠及定量磷酸化蛋白組學(xué)等方法，發(fā)現(xiàn)MTH1對(duì)血小板線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激發(fā)揮保護(hù)作用并參與調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）介導(dǎo)的血小板功能和血栓形成，提示MTH1可能是預(yù)防血栓性疾病的潛在治療靶點(diǎn)。
參考文獻(xiàn)：
[1]Melchinger H, Jain K, Tyagi T, Hwa J. Role of Platelet Mitochondria: Life in a Nucleus-Free Zone. Front Cardiovasc Med 6, 153 (2019).
[2]Kholmukhamedov A, Jobe S. Platelet respiration. Blood Adv 3, 599-602 (2019).
[3]Hayashi T, Tanaka S, Hori Y, Hirayama F, Sato EF, Inoue M. Role of mitochondria in the maintenance of platelet function during in vitro storage. Transfus Med 21, 166-174 (2011).
[4]Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature 362, 709-715 (1993).
[5]Nakabeppu Y. Molecular genetics and structural biology of human MutT homolog, MTH1. Mutat Res 477, 59-70 (2001).
[6]Ding Y, Gui X, Chu X, Sun Y, Zhang S, Tong H, Ju W, Li Y, Sun Z, Xu M, Li Z, Andrews RK, Gardiner EE, Zeng L, Xu K, Qiao J. MTH1 protects platelet mitochondria from oxidative damage and regulates platelet function and thrombosis. Nat Commun. 2023 Aug 10;14(1):4829.
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Nudt1 flox小鼠（Mth1 flox小鼠）
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品系名稱(chēng)：
C57BL/6J-Nudt1em1Cflox/Cya
品系編號(hào)：
CKOCMP-17766-Nudt1-B6J-VA
產(chǎn)品編號(hào)：
S-CKO-03821
應(yīng)用方向：
代謝,腫瘤,呼吸系統(tǒng),消化系統(tǒng),糖代謝,線(xiàn)粒體研究,水解酶,RNA結(jié)合蛋白
打靶方案：
參考文獻(xiàn)：
[1]Melchinger H, Jain K, Tyagi T, Hwa J. Role of Platelet Mitochondria: Life in a Nucleus-Free Zone. Front Cardiovasc Med 6, 153 (2019).
[2]Kholmukhamedov A, Jobe S. Platelet respiration. Blood Adv 3, 599-602 (2019).
[3]Hayashi T, Tanaka S, Hori Y, Hirayama F, Sato EF, Inoue M. Role of mitochondria in the maintenance of platelet function during in vitro storage. Transfus Med 21, 166-174 (2011).
[4]Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature 362, 709-715 (1993).
[5]Nakabeppu Y. Molecular genetics and structural biology of human MutT homolog, MTH1. Mutat Res 477, 59-70 (2001).
[6]Ding Y, Gui X, Chu X, Sun Y, Zhang S, Tong H, Ju W, Li Y, Sun Z, Xu M, Li Z, Andrews RK, Gardiner EE, Zeng L, Xu K, Qiao J. MTH1 protects platelet mitochondria from oxidative damage and regulates platelet function and thrombosis. Nat Commun. 2023 Aug 10;14(1):4829.
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