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圖1 CAND1在NAFLD患者，HFD小鼠和PA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞中低表達(dá)[[1] 

研究人員在NAFLD患者和正常供者的肝活檢樣本中檢測(cè)了CAND1的表達(dá)水平。與正常供體相比，NAFLD患者肝臟組織中CAND1 mRNA和蛋白質(zhì)含量降低。與對(duì)照組相比，HFD喂養(yǎng)后小鼠肝臟中CAND1 mRNA和蛋白質(zhì)水平也顯著降低。此外，AML12和THLE-2細(xì)胞暴露于棕櫚酸（PA）24小時(shí)后，CAND1 mRNA和蛋白質(zhì)水平也顯著降低，這些結(jié)果表明，CAND1在NAFLD的發(fā)展中起著合理的作用，如圖1所示。 

圖2 肝細(xì)胞特異性CAND1缺乏加劇了雄性小鼠hfd誘導(dǎo)的肝損傷[1] 

為了驗(yàn)證CAND1對(duì)肝細(xì)胞的特異性作用，研究人員使用賽業(yè)生物提供的CAND1flox/flox小鼠與Alb-cre工具鼠雜交構(gòu)建了肝細(xì)胞特異性CAND1敲除（條件敲除，cKO）雄性小鼠。值得注意的是，在HFD治療后，WT和CAND1 cKO小鼠的食物攝入量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HFD處理增加了16周后WT和CAND1 cKO小鼠的體重和附睪脂肪重量，WT-HFD和CAND1 cKO-HFD小鼠的體重和附睪脂肪重量相當(dāng)。CAND1 cKO-HFD小鼠的LB/BW比增加。與WT-HFD小鼠相比，CAND1 cKO-HFD小鼠的TG和TC水平顯著升高。H&E和油紅O染色顯示，CAND1 cKO-HFD小鼠肝臟中的脂質(zhì)積累比WT-HFD小鼠更嚴(yán)重。CNAD1 cKO-HFD小鼠表現(xiàn)出更高的空腹血糖、胰島素濃度和HOMA-IR。此外，與WT-HFD小鼠相比，CAND1 cKO-HFD小鼠表現(xiàn)出更強(qiáng)的葡萄糖耐量和胰島素敏感性。肝臟炎癥是NAFL發(fā)展為NASH的常見(jiàn)病理改變。與WT-HFD小鼠相比，CAND1 cKO-HFD小鼠肝臟中促炎因子的表達(dá)增加。然而，WT-HFD和CAND1 cKO-HFD小鼠的纖維化面積和血清αFP（肝癌標(biāo)志物）水平?jīng)]有差異。這些發(fā)現(xiàn)表明肝細(xì)胞中CAND1缺乏加重了hfd誘導(dǎo)的肝損傷，如圖2所示。 

圖3 肝細(xì)胞特異性CAND1過(guò)表達(dá)改善雄性小鼠hfd誘導(dǎo)的肝損傷[1] 

研究人員進(jìn)一步使用賽業(yè)生物提供的CAND1knockin小鼠與Alb-cre工具鼠雜交建立了肝細(xì)胞特異性CAND1過(guò)表達(dá)（條件敲入，cKI）雄性小鼠系，以驗(yàn)證肝細(xì)胞CAND1對(duì)HFD治療后肝損傷的功能。HFD或NC治療后，WT與CAND1 cKI小鼠的進(jìn)食量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HFD治療在HFD治療16周后增加了WT和CAND1 cKI雄性小鼠的體重和附睪脂肪重量，WT-HFD和cKI-HFD小鼠的體重和附睪脂肪重量相當(dāng)。與CAND1 cKO小鼠的變化相反，肝細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)CAND1在很大程度上保護(hù)了HFD誘導(dǎo)的肝脂肪變性、肝抵抗和炎癥。具體而言，肝細(xì)胞中CAND1的過(guò)表達(dá)改善了肝脂肪變性，降低了LW/BW比和肝臟中TG和TC的含量。與WT-HFD小鼠相比，CAND1 cKI-HFD小鼠的糖耐量和胰島素敏感性顯著提高。此外，CAND1 cKI-HFD小鼠的促炎因子mRNA水平低于WT-HFD小鼠。天狼星紅染色顯示W(wǎng)T-HFD和cKI-HFD雄性小鼠的纖維化面積沒(méi)有差異。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了CAND1在hfd誘導(dǎo)的肝損傷中的保護(hù)作用，如圖3所示。 

圖4 CAND1控制脂肪酸β-氧化基因ACAA2的泛素化降解[1] 

圖5 CAND1抑制Cullin1、FBXO42和ACAA2復(fù)合物的形成[1] 

CAND1通過(guò)調(diào)節(jié)含有底物受體的F-box和Cullin1復(fù)合物的組裝來(lái)控制全局CRLs網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)力學(xué)。為了闡明CAND1調(diào)控NAFLD發(fā)展的機(jī)制，研究人員進(jìn)行了Co-IP和質(zhì)譜分析，以鑒定轉(zhuǎn)染NC或siCAND1的PA處理的L02細(xì)胞中的cullin1結(jié)合蛋白。共獲得72個(gè)解除調(diào)控的cullin1結(jié)合蛋白，其中39個(gè)基因上調(diào)，33個(gè)基因下調(diào)。在上調(diào)基因中，乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶2（ACAA2）和F-box蛋白42（FBXO42）引起了研究人員的注意。ACAA2是一種脂肪酸β氧化的硫解酶，其過(guò)表達(dá)可促進(jìn)脂肪酸氧化并抑制脂質(zhì)積累。F-box蛋白FBXO42是一種底物受體，可招募靶蛋白并促進(jìn)其泛素化降解。他們推測(cè)Cullin1、FBXO42和ACAA2可能形成一個(gè)SCF復(fù)合物，調(diào)節(jié)ACAA2的泛素化和降解，從而影響CAND1對(duì)NAFLD的作用。分子對(duì)接也預(yù)測(cè)了FBXO42與ACAA2和Cullin1結(jié)合。 

研究人員檢測(cè)了Cullin1、FBXO42和ACAA2復(fù)合物在AML12和THLE-2細(xì)胞中的形成。PA處理后siCAND1中ACAA2、Cullin1和FBXO42復(fù)合物的形成較NC組明顯增加，PA處理后siCAND1中ACAA2蛋白表達(dá)較NC組明顯下調(diào)。 

與WT小鼠相比，WT-hfd小鼠的ACAA2蛋白表達(dá)明顯降低。與WT-hfd小鼠相比，CAND1 cKO-HFD小鼠的ACAA2蛋白顯著降低，表明ACAA2泛素化程度較高。CAND1 cKI-HFD雄性小鼠的ACAA2蛋白顯著上調(diào)，泛素化水平明顯降低。 

接下來(lái)，研究人員用Co-IP法檢測(cè)Cullin1、FBXO42和ACAA2復(fù)合物。與WT小鼠相比，WT-hfd小鼠中ACAA2、Cullin1和FBXO42復(fù)合物的形成明顯增加，且CAND1 cKO-HFD中ACAA2、Cullin1和FBXO42復(fù)合物的含量高于WT-hfd小鼠。然而，與WT-HFD小鼠相比，CAND1 cKI-HFD小鼠中ACAA2、Cullin1和FBXO42復(fù)合物的含量較少。這些結(jié)果表明，CAND1抑制ACAA2、Cullin1和FBXO42復(fù)合物的組裝，從而抑制ACAA2的泛素化降解，如圖4，5所示。 

圖6 ACAA2過(guò)表達(dá)可改善因CAND1缺陷增強(qiáng)的雄性小鼠肝脂肪變性、胰島素抵抗和炎癥[1] 

為了進(jìn)一步闡明CAND1對(duì)NAFLD的調(diào)節(jié)作用是否由ACAA2介導(dǎo)，研究人員通過(guò)尾靜脈向雄性小鼠注射AAV8-ACAA2病毒，特異性提高了ACAA2在肝細(xì)胞中的表達(dá)。ACAA2過(guò)表達(dá)大大改善了CAND1 cKO-HFD小鼠的病理改變，包括LB/BW比、肝臟TG和TC水平以及脂質(zhì)積累。此外，ACAA2過(guò)表達(dá)顯著消除了CAND1條件敲除對(duì)飼喂HFD小鼠的空腹血糖、空腹胰島素和HOMA-IR指數(shù)的加重作用。此外，ACAA2過(guò)表達(dá)改善了CAND1 cKO-HFD小鼠的葡萄糖耐量和胰島素敏感性，這一點(diǎn)通過(guò)腹腔注射GTT和ITT得到了證明。ACAA2過(guò)表達(dá)也降低了CAND1 cKO-HFD小鼠中促炎因子IL-6、TNF-α和TLR-4的水平。這些結(jié)果表明，肝細(xì)胞CAND1對(duì)NAFLD進(jìn)展的影響是由ACAA2介導(dǎo)的，如圖6所示。 

圖7 肝細(xì)胞特異性CAND1敲除促進(jìn)雄性小鼠饑餓誘導(dǎo)的脂肪肝[1] 

在禁食條件下，過(guò)量的脂肪酸被重新酯化成甘油三酯，在肝臟細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存，從而導(dǎo)致饑餓性脂肪肝。然后，研究人員探討了CAND1是否也對(duì)饑餓誘導(dǎo)的脂肪肝有調(diào)節(jié)作用。在雄性小鼠饑餓24h后，他們檢測(cè)了肝臟脂質(zhì)的積累。結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，CAND1 cKO雄性小鼠饑餓后肝臟脂質(zhì)積累更為嚴(yán)重。CAND1 cKO雄性小鼠肝臟中TG和TC水平也顯著升高。此外，CAND1 cKO中ACAA2水平顯著降低。這些數(shù)據(jù)表明，CAND1也抑制饑餓誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)代謝，如圖7所示。 

由于NAFLD肝臟中CAND1的mRNA水平降低，他們隨后探索了CAND1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。研究人員使用JASPAR網(wǎng)站預(yù)測(cè)了CAND1基因的轉(zhuǎn)錄因子，并在CAND1基因的啟動(dòng)子區(qū)域確定了四個(gè)雄激素受體（AR）的潛在結(jié)合位點(diǎn)。他們觀察到NAFLD雄性小鼠與正常鼠相比睪酮和AR水平下降。PA誘導(dǎo)后AML12細(xì)胞中AR表達(dá)也下降。有趣的是，與WT雄性小鼠相比，CAND1 cKO雄性小鼠的AR表達(dá)和睪酮水平顯著降低。 

為了闡明AR對(duì)CAND1轉(zhuǎn)錄的直接影響，研究人員將AR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和含有順序截?cái)嗟腃AND1啟動(dòng)子的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。在CAND1啟動(dòng)子區(qū)域鑒定了四個(gè)推測(cè)的AR結(jié)合位點(diǎn)。這些結(jié)合位點(diǎn)的序列缺失表明，ar結(jié)合位點(diǎn)1是ar促進(jìn)CAND1轉(zhuǎn)錄活性的主要位點(diǎn)。此外，睪酮處理上調(diào)了AML12細(xì)胞中CAND1的mRNA和蛋白水平。pa誘導(dǎo)的脂質(zhì)積累在siCAND1組和siAR組相似。在AML12細(xì)胞中，與單獨(dú)敲低CAND1相比，AR和CAND1的同時(shí)敲低加重了PA誘導(dǎo)的脂質(zhì)積累，而在PA處理后，CAND1的過(guò)表達(dá)減輕了AR缺陷引起的AML12細(xì)胞中的脂質(zhì)積累。研究人員給雄性小鼠服用AR拮抗劑enzalutamide（10mg/kg），發(fā)現(xiàn)CAND1 mRNA和蛋白水平顯著降低。并且，小鼠出生后2-6個(gè)月肝臟中CAND1水平升高，12個(gè)月時(shí)下降，這與AR的表達(dá)變化一致。這些結(jié)果表明，CAND1的轉(zhuǎn)錄受雄激素受體的調(diào)節(jié)，如圖8所示。 

圖9 CAND1在調(diào)節(jié)ACAA2泛素化和降解中的作用[1] 

在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)CAND1阻斷Cullin1、FBXO42和ACAA2復(fù)合物的組裝，抑制ACAA2的泛素化降解，從而維持肝細(xì)胞內(nèi)脂肪酸降解的速度，減少肝臟內(nèi)脂質(zhì)積累。雄激素受體通過(guò)結(jié)合-187到-2000啟動(dòng)子區(qū)域來(lái)決定CAND1的轉(zhuǎn)錄。研究結(jié)果表明，CAND1是治療NAFLD的一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。