膀胱結石是常見的泌尿系統(tǒng)疾病，地理區(qū)域、種族分布、社會經(jīng)濟以及飲食習慣均會影響其發(fā)病率。原發(fā)性結石主要是營養(yǎng)因素所致。繼發(fā)性結石形成原因復雜，良性前列腺增生癥、尿路感染、膀胱增大、膀胱憩室、膀胱異物或神經(jīng)源性膀胱等因素都可能成為誘因?；颊甙Y狀可表現(xiàn)為血尿、腹痛、繼發(fā)于梗阻的尿潴留和復發(fā)性尿路感染等，同時增加終末期腎病、膀胱癌甚至死亡的風險。
膀胱結石疾病研究的關鍵是建立合適的動物模型。大、小鼠是結石疾病研究中最常用的2種實驗動物?，F(xiàn)有膀胱結石的建模方法雖多，但常被概括為泌尿系統(tǒng)結石，且少有文獻對膀胱結石動物模型制備方法、特征和有效性進行歸類總結。本綜述將膀胱結石動物模型的制備方法歸納為4類，即物理誘導、化學誘導、微生物誘導和基因敲除，并從制備方法、模型特點和應用等方面進行綜述，為膀胱結石的進一步研究提供參考。
1. 物理誘導模型
膀胱中的異物可成為結石形成的病灶，尤其膀胱內醫(yī)源性異物，如膀胱內器械移位或斷裂、手術紗布、非吸收性縫合線等?；诋愇餀C制構建的模型稱為物理誘導模型。鋅盤、塑料片和非吸收性外科縫合線均可作為植入材料。
1.1 鋅盤植入模型
鋅盤植入模型最早于19世紀50年代建立，是藥物抗尿石作用非臨床研究的常用方法。大鼠麻醉后切開下腹暴露膀胱，打開膀胱腔將已知重量和尺寸的鋅盤植入其內，用可吸收外科縫合線縫合。大鼠術后恢復約3 d即可應用于藥效學研究，通過鋅盤周圍沉積物的重量變化來評估藥效。
早期模型中鋅盤重量為10～48 mg，觀察時間長達6～8周。大鼠膀胱長期暴露于植入物易形成較大的晶體沉積，不僅增加了動物的痛苦，還可能導致腎功能嚴重紊亂和尿路感染。使用約20 mg的鋅盤植入膀胱，建模第10天可觀察到明顯的結石（均重約75.4 mg）。隨著觀察時間延長，第20天和第48天結石均重分別可達85.3和257.3 mg。因此，建議將觀察周期（藥效評估周期）縮短至10～20 d。大鼠膀胱中植入重量小于10 mg、直徑最小為2 mm的鋅盤，10 d后X射線顯影可見鋅盤周圍有晶體沉積，并伴隨尿肌酐、尿白蛋白水平顯著升高和腎小球濾過率降低。改進后的模型最大限度地降低了膀胱壁損傷和出血。
1.2 經(jīng)膀胱穿線模型
手術后尿路管腔中的縫合材料（手術釘或永久縫合線）歷來被視為引起結石的危險因素，縫合線誘導的尿石癥也被用作大鼠尿石癥的可預測模型。經(jīng)膀胱穿線模型的制備方法為：成年大鼠經(jīng)麻醉、消毒后，于下腹開一小孔露出膀胱，在膀胱頂部剪開約0.5 cm切口；將絲線一端以縫合針穿過膀胱壁后，兩端打結，一端留置膀胱內，另一端在膀胱外，縫合膀胱并復位。5周后解剖取出膀胱內線結上的結石，清洗并干燥后稱重。
研究表明，縫合線的材質決定了結石的嚴重程度、發(fā)育時間以及結石成分。膀胱腔內線結越多，越易引起結石，結石量也越多。如膀胱內留有縫合材料或線結，5周后平均每100 g大鼠可產(chǎn)生25 mg結石，否則將僅在絲線表面形成鈣質沉淀。形成結石的程度與材料有關，鉻腸線最易引起結石，絲綢次之，聚酯材料再次之。
1.3 膀胱埋石模型
隨時間發(fā)展，膀胱內的異物最終會形成多層結石。基于異物結石機制，手術中取出的人體結石碎片也是不錯的植入選擇材料。該模型的制備方法與鋅片植入模型類似。選取預先處理的結石碎片（直徑2～3 mm）埋入成年雄性大鼠膀胱內，3周后解剖取出膀胱結石，清洗并干燥后稱重，模型組結石重量增加116%。
物理誘導方法構建的模型中形成的結石以磷酸銨鎂晶體和草酸鈣為主。如建模過程中大鼠口服乙二醇，則植入物周圍形成晶體的主要構成為草酸鈣。這類模型曾用于石淋消湯、復方芭蕉芯顆粒和二金排石湯等多種中藥溶石劑的藥效評價，其優(yōu)點是在時間、成分和結石形成量方面具有可預測性，且任何安全、穩(wěn)定的材料均可用作植入材料。利用α-氰基丙烯酸正丁酯遇血凝固的特性，采用18 G穿刺針在超聲引導下穿刺進入腎盂，將0.5～1.0 mL組織黏合劑注入腎盂后迅速注入豬血，B超驗證模型制備成功。向腔體注射可凝固液體可迅速形成結石，這為我們提供了思路，但尚未在嚙齒類動物中發(fā)現(xiàn)使用該類型材料的報道。缺點是操作中動物手術不可避免，對人員要求高且增加了動物死亡的風險。總之，物理誘導模型可靠且有效，且利用非溶解性異物所建的模型有助于定量評估藥物的消石能力。
2 化學誘導模型
化學誘導模型是指實驗動物長期暴露于一種或多種化學物質，即誘石劑而形成的模型。誘石劑包括藥物、化學品和食品添加劑等。目前，化學誘導模型是研究最多的一類模型，原因在于結石易感人群的飲食習慣和營養(yǎng)成分中的化學物質暴露是膀胱結石病因學研究的一個主要方向。
2.1 乙二醇誘導模型
乙二醇誘導模型是應用最廣泛的結石模型之一，多與氯化銨或維生素D3聯(lián)用。乙二醇是草酸代謝通路的中間產(chǎn)物，進入體內轉化成羥乙酸或乙醛酸，繼而轉化為草酸；氯化銨能降低尿pH值，導致代謝性酸中毒。聯(lián)合使用氯化銨和乙二醇，3～4周后解剖，可觀察到模型大鼠和小鼠腎、膀胱和輸尿管中有不規(guī)則、折光性較強的草酸鈣晶體。用該方法誘導結石4周，可觀察到模型大鼠攝食、飲水均減少，表現(xiàn)出消瘦、冷漠、不活躍和體毛變少的特征。尿液分析發(fā)現(xiàn)，模型大鼠尿液pH和尿量低于正常組，而尿鈣和尿鎂水平升高。草酸鈣結石在各種結石中比例最高，乙二醇及其代謝通路在草酸鈣結石形成中起重要作用。近期研究表明，P38絲裂原活化蛋白激酶通路與乙二醇誘導而成的泌尿系統(tǒng)結石密切相關。P38蛋白磷酸化激活后，調控包括氧化因子、促炎因子等在內的一系列基因轉錄。有研究表明，消石劑金錢草提取物通過抑制P38絲裂原活化蛋白激酶通路，而抑制草酸鈣結石的形成。
乙醛酸和羥脯氨酸等中間代謝產(chǎn)物也可直接作為誘石劑使用。C57BL/6L小鼠ip給予乙醛酸溶液75 mg·kg-1，連續(xù)給藥2周可建模成功；在大鼠飼料中加入5%(w/w）羥脯氨酸，約4周可造模成功。采取動物自由攝入含誘石劑飼料的方法構建模型，雖然也有成功報導且適當?shù)暮喕斯ぷ髁鞒蹋⒉荒軠蚀_計算誘石劑在模型動物體內的暴露劑量。維生素D3具有促進腸道鈣吸收的作用，過量暴露易造成高鈣尿癥，促進草酸鈣結石形成。乙二醇結合維生素D3構建模型能有效提高模型成功率。
2.2 三聚氰胺誘導模型
三聚氰胺是具有輕微毒性的化工原料。《國際化學品安全卡》（International Chemical Safety Cards，ICSC）明確指出，長期或反復大量攝入含三聚氰胺的食品，可能對腎和膀胱產(chǎn)生危害，最終導致結石。
多項研究發(fā)現(xiàn)，三聚氰胺0.05～0.4 g·kg-1連續(xù)ig給藥30 d，可誘發(fā)雄性大鼠產(chǎn)生膀胱結石；三聚氰胺0.4 g·kg-1給藥20 d，膀胱結石率可達60%，結石率具有劑量-反應關系；同時血清中尿素氮、肌酐和尿酸含量均升高，且無腎毒性指征。如以小鼠為模型動物，喂食含有0.9397%（w/w）三聚氰胺的飲食，2周后小鼠出現(xiàn)大量膀胱結石，伴隨膀胱黏膜層嚴重受損，膀胱結石率高達70%。
有研究指出，結石是同時攝入三聚氰胺和三聚氰酸（工業(yè)雜質）形成難溶性化合物（氰尿酸-三聚氰胺）在腎小管沉積的結果，單獨使用一種化合物不會形成結石。筆者推測，該結論不同于前述研究可能是混合物的暴露劑量小或暴露周期短導致的。僅以121 mg·kg-1三聚氰胺-三聚氰酸的羧甲基纖維素鈉混合液ig給藥1周建模成功，劑量和周期均遠低于前述建模方案，抑或兩者可能有不同的結石形成機制。
2.3 對苯二甲酸誘導模型
對苯二甲酸（Terephthalic Acid，TPA）是常用的化學品，長期暴露于二甲基對苯二甲酸酯及其體內代謝物TPA的人或動物較容易產(chǎn)生尿酸中毒、電解質消除改變和高鈣尿，導致尿液中對苯二甲酸鈣（CaTPA）和磷酸氫鈣（CaHPO4）結晶過飽和，并最終形成膀胱結石。在飼料中加入5%TPA飼養(yǎng)14 d，大鼠膀胱腔內均有數(shù)顆鈣化小體，成石率高達100%。該模型誘發(fā)的大鼠膀胱結石，伴有膀胱移行上皮增生，部分膀胱組織中可觀察到以上皮細胞為內襯的囊腫。在大鼠TPA 90 d亞慢性毒性研究中檢測到21/52例尿石癥，伴有尿液pH值顯著降低、尿量顯著升高的現(xiàn)象。在TPA毒理學回顧性研究中，TPA導致結石的效應呈陡峭的劑量-反應曲線。TPA1000 mg·kg-1可導致大鼠膀胱結石、膀胱增生和腫瘤，當劑量降至142 mg·kg-1以下時該效應消失。
TPA誘導的大鼠尿石癥和人自發(fā)性尿石癥相似，并伴有高鈣尿和酸尿，對氯噻嗪治療有反應。該模型成功率高，短期建模以形成鈣結石小體為主，部分不可見的微結石需采用Von Kossa染色法檢測?，F(xiàn)有研究使用TPA構建結石模型的報道相對較少，可能與TPA對其他臟器的毒性有關。
2.4 酒石酸膽堿誘導模型
酒石酸和酒石酸膽堿是合法的食品添加劑，在體內形成不溶于水的酒石酸鈣。飲食中含有大量酒石酸鹽的大鼠的尿路易產(chǎn)生以四水酒石酸鈣為主的結石，其機制尚未深入研究。
以含有酒石酸膽堿的飼料喂食雄性C57BL/6J小鼠，自由飲水。4周后，小鼠膀胱上皮呈現(xiàn)“毛刺樣”；20周后，小鼠膀胱出現(xiàn)大量結石，膀胱黏膜層嚴重受損，但未見腎結晶和腎損傷。經(jīng)傅里葉轉換紅外光譜分析，膀胱結石的化學成分為四水酒石酸鈣，該結果與1例過度攝入酒石酸鹽飲料臨床患者的結石成分高度匹配。比較酒石酸膽堿、三聚氰胺和乙二醇3種結石誘導劑的建模結果，發(fā)現(xiàn)乙二醇模型組和三聚氰胺模型組小鼠均表現(xiàn)出明顯的腎損傷，而酒石酸膽堿可誘導原發(fā)性膀胱結石而不致腎損傷。
化學誘導模型中尿結石形成機制符合尿結石形成學說中的“過飽和結晶學說”。當體內難溶性化合物量超出泌尿系統(tǒng)的排泄能力時，形成難溶的晶體，成為尿結石核心?；瘜W誘導模型動物死亡率低、易操作、誘石劑種類多，已廣泛用于多種抗結石藥物的藥理及藥效學等方面的研究，如豬苓、廣金錢草注射液、加味烏茹湯、消石素和五淋化石丹等。但在具體操作中，已知誘石劑仍然存在許多不確定性，主要表現(xiàn)在誘石劑的暴露量與成石率并不具有明顯的劑量-反應關系；動物泌尿系統(tǒng)中形成大量晶體，導致腎和輸尿管結石，并可能損傷其他臟器，不利于藥物評估；動物品系和個體差異大，如Wistar雄性大鼠對乙二醇誘導的腎毒性最敏感。
3 微生物誘導模型
感染性結石占尿路結石的5%～15%，由尿素酶陽性病原體（真菌、細菌、支原體等，也稱解脲酶微生物）持續(xù)性感染尿路引起，結石成分以鳥糞石（磷酸銨鎂）為主。解脲酶微生物感染尿路后產(chǎn)生的脲酶能分解尿素產(chǎn)生氨和CO2，顯著改變尿液pH值（7.2～8.0），膀胱中尿液持續(xù)處于這種pH下易形成晶體。常見的解脲酶微生物有奇異變形桿菌、銅綠假單胞菌、梭狀芽胞桿菌、乳桿菌和葡萄球菌等，前兩者通常為優(yōu)勢菌群。
在建模操作中，膀胱內的菌液易隨尿液排出，直接注入感染源微生物菌液的成石率低且速度慢。故微生物誘導模型常與物理誘導方法聯(lián)用，如鋅盤和各種聚乙烯材料等，延長感染菌在膀胱的滯留時間，有效提髙模型成功率。最早在鋅盤植入模型的基礎上，將1010CFU·L-1的奇異變形桿菌接種入膀胱，5 d后成功誘導了輕度感染模型；3周后，結石均重達88.3 mg。將無菌微細聚乙烯管（兩端打圓）與細菌菌液共同培養(yǎng)后，用18 G穿刺針將微細聚乙烯管推入膀胱，接種后僅6 d即可觀察到結石，3周后模型成功率達100%。通過金屬導絲推桿將異物（聚乙烯材料）置入大鼠膀胱內，每隔2 d灌注1次脆弱擬桿菌菌液（109CFU·L-1，約1.5 mL），連續(xù)3周，大鼠膀胱內均可見結石；且灌注組與對照組（僅推入異物）相比差異有統(tǒng)計學意義。這表明通過接種微生物建模的方法是可靠的，且感染主要局限于下尿路，對腎損傷小，經(jīng)尿道置入膀胱異物并結合微生物誘導可顯著提高膀胱結石率。
解脲酶微生物在誘導大鼠膀胱結石中起著重要作用。感染的作用是增強結石的形成。當尿液無菌時，使用腸線或聚乙醇酸縫合線的大鼠結石率僅20%；而在有解脲酶微生物存在的情況下，結石率高達80%～100%。如前所述，大多數(shù)學者認為解脲酶微生物是通過改變尿液pH為形成結石提供了適宜的理化環(huán)境；但患結石大鼠的尿液中促炎性細胞因子水平高于正常大鼠，如人白細胞介素8大鼠類似物（GRO/KC）及白細胞介素1α和1β，認為膀胱中的炎癥反應很可能是結石形成過程中的關鍵因素，其機制還需進一步研究。
微生物誘導的膀胱結石模型具有成石速度快、術后死亡率低、感染范圍僅限于膀胱的優(yōu)點，但也存在技術難以掌握的缺點。該模型已廣泛用于疾病發(fā)生機制及治療膀胱結石的有效性評價，如評估香草酸和排石湯顆粒等藥物的抑石作用。
4 基因敲除模型
胱氨酸尿是以腎內堿性氨基酸（包括胱氨酸、鳥氨酸、賴氨酸和精氨酸）轉運障礙為特征的遺傳性疾病，屬常染色體隱性遺傳，常伴有慢性腎病。目前基因敲除技術已經(jīng)被應用于這種特殊的膀胱結石疾病研究。
胱氨酸尿與2個編碼基因溶質載體家族3成員1（solute carrier family 3 member 1，Slc3a1）和Slc7a9的突變有關，它們分別編碼異源二聚胱氨酸轉運蛋白的rBAT和b0,+AT亞單位。該轉運蛋白主要負責胱氨酸在腎小管和小腸上皮細胞的重吸收。將Slc7a9-/-Slc3a1+/+小鼠與Slc7a9+/+Slc3a1-/-小鼠雜交后獲得的F1代雜合子小鼠進行自交，發(fā)現(xiàn)F2代小鼠中雙雜合子小鼠（Slc7a9+/-Slc3a1+/-）比單雜合子小鼠（Slc7a9+/-Slc3a1+/+和Slc7a9+/+Slc3a1+/-）胱氨酸排泄率更高，表明這種胱氨酸尿模型是雙基因遺傳。Slc3a1或Slc7a9突變均可引起堿性氨基酸的轉運缺陷，分別導致A型或B型胱氨酸尿，或同時導致AB型胱氨酸尿?；蚯贸∈螅⊿lc7a9-/-和/或Slc3a1-/-）初期癥狀表現(xiàn)為尿液中胱氨酸含量增加，在4周齡時腎結石和膀胱結石基本形成，并持續(xù)生長，尿液中可見六角形晶體；藥效研究一般選用2～3月齡的雄性小鼠，該階段小鼠的結石發(fā)生率更高，如Slc3a1-/-小鼠可達50%。組織病理改變主要體現(xiàn)在腎，如腎小管和盆腔擴張、腎小管壞死、腎小管透明液滴和慢性間質性腎炎。A型和B型胱氨酸尿小鼠模型中存在基因型/表型相關性，為進一步研究胱氨酸尿患者遺傳機制提供了新的見解。
研究者已應用該模型驗證了青霉胺（D-penicil?lamined）、α-硫辛酸（α-lipoicacid）和托爾瓦普坦（tolvaptan）在增加尿胱氨酸的溶解度及抑制Slc3a1-/-小鼠胱氨酸尿模型中胱氨酸結石形成的作用，并發(fā)現(xiàn)L-胱氨酸二甲酯（L-cystine dimethyl ester）雖不能阻斷結石的產(chǎn)生，但能抑制胱氨酸晶體持續(xù)生長。這些發(fā)現(xiàn)提供了一種構建有效的胱氨酸尿石癥模型的思路，可用于研究導致該疾病的遺傳和環(huán)境因素，并可用于藥物評估。
結語
膀胱結石在發(fā)展中國家和快速老齡化的發(fā)達國家都是常見的臨床問題。膀胱及相關泌尿系統(tǒng)結石成因復雜，過程涉及遺傳、飲食和自身代謝及曾發(fā)生的物理和化學事件。各類結石動物模型均有其優(yōu)缺點和非臨床研究的適用性。與化學誘導模型相比，物理和微生物誘導模型主要針對膀胱，對其他臟器影響較??；但一項體外模型研究發(fā)現(xiàn)，解脲酶微生物也能從膀胱向上游遷移到輸尿管和腎，隨后在腎中形成生物膜和結石。受遺傳學研究進展的限制，基因敲除方法目前僅應用于制備某種特定的結石模型，應用面相對較小?，F(xiàn)有模型的一些共有特征可總結為：
①建模動物以大鼠為主，其次選用小鼠、貓或豬。
②模型可能存在動物性別的差異。在化學誘導模型中，雌性動物體內形成的結石在一定程度上小于雄性；而微生物誘導模型中雌性動物的成石率更高=。目前的研究尚未闡明這種性別差異是由激素水平還是解剖特征引起的，或者兼而有之。
③動物品系差異。如在微生物誘導模型中，F(xiàn)344大鼠的易感性最高，SD大鼠次之，Lewis大鼠和Wistar大鼠易感性最弱。
然而，現(xiàn)有模型尚存在以下不足：
①判斷標準不一。當前研究中提到的判斷標準有肉眼觀察、結晶尿、解剖組織顯微觀察、組織病理學檢查等；后期研究應達成一致的判斷標準，使各研究間能夠進行合理的比較。
②模型動物血液、尿液等生化指標結果不一致，尤其是鎂和鈣，常在同種或不同模型中表現(xiàn)出差異。
③人們對結石形成信號通路中的特異性標志物知之甚少。有報導推測，血清中NADH脫氫酶1α亞復合物亞基8和免疫球蛋白超家族中的一種跨膜糖蛋白basigin可能是三聚氰胺誘導膀胱結石的潛在生物標志物。
④無法回避的副作用。尤其是化學誘導模型，雖然被廣泛應用，但可能導致代謝性酸中毒、細胞損傷和腎小管上皮細胞壞死等，副作用大；改用結石形成中間代謝產(chǎn)物或者信號通路中的信號因子作為誘導劑，也許能建立更加安全、合理的疾病模型。
⑤現(xiàn)有的模型高度依賴于人工誘導，可能并不完全適用于天然結石形成的研究。
誠然，自然界中存在一些自發(fā)性尿路結石的動物模型，包括圈養(yǎng)或野生動物，如狗、貓、水獺、海豚和雪貂等。這些自發(fā)性模型的發(fā)病機制也許更接近人類膀胱結石發(fā)生的真相，很可能成為膀胱結石模型的廣闊寶庫。
Source: 中國藥理學與毒理學雜志. 2024, 38 (06)，膀胱結石嚙齒類動物模型的制備方法及應用進展
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